Ο ρόλος της PCSK9 στην αθηροθρόμβωση
Φόρτωση...
Ημερομηνία
Συγγραφείς
Τσούκα, Αικατερίνη
Τίτλος Εφημερίδας
Περιοδικό ISSN
Τίτλος τόμου
Εκδότης
Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων. Σχολή Θετικών Επιστημών. Τμήμα Χημείας
Περίληψη
Τύπος
Είδος δημοσίευσης σε συνέδριο
Είδος περιοδικού
Είδος εκπαιδευτικού υλικού
Όνομα συνεδρίου
Όνομα περιοδικού
Όνομα βιβλίου
Σειρά βιβλίου
Έκδοση βιβλίου
Συμπληρωματικός/δευτερεύων τίτλος
Περιγραφή
Εισαγωγή- Σκοπός: Η PCSK9 είναι μια σερινο-πρωτεάση οποία εκτός από τον κύριο ρόλο της στην ενδοσωμική και λυσοσωμική αποικοδόμηση του υποδοχέα της LDL, η οποία έχει ως αποτέλεσμα την αύξηση των επιπέδων της LDL-χοληστερόλης στο πλάσμα, παρουσιάζει αρκετές, ανεξάρτητες, από τον LDL υποδοχέα, δράσεις σε πληθώρα κυτταρικών τύπων, συμπεριλαμβανομένων των αιμοπεταλίων. Πρόσφατες μελέτες έχουν αποδείξει ότι η PCSK9 συμμετέχει στην παθοφυσιολογία της φλεγμονής και εμφανίζει δράσεις και σε άλλους κυτταρικούς τύπους, όπως αιμοπετάλια, μονοκύτταρα κ.α. Υλικά-Μέθοδοι: Αρχικά μελετήθηκε η αλληλεπίδραση της PCSK9 με τις λιποπρωτεΐνες του πλάσματος απομονώνοντας αυτές με τη μέθοδο των διαδοχικών υπερφυγοκεντρήσεων και προσδιορίζοντας τα επίπεδα τους σε PCSK9 με τη μέθοδο ELISA. Παράλληλα, μελετήσαμε την κατανομή της PCSK9 στα σωματίδια της HDL λιποπρωτεΐνης με το σύστημα Lipoprint ενώ η μορφή της PCSK9 που υπάρχει σε κάθε λιποπρωτεΐνη προσδιορίστηκε με τη μέθοδο της ανοσοαποτύπωσης (Western Blotting). Για να διερευνήσουμε τη δράση της PCSK9 στη θρόμβωση προσδιορίσαμε τα επίπεδα της ενδογενούς PCSK9 σε πλυμένα αιμοπετάλια που απομονώθηκαν από νορμολιπιδαιμικούς δότες ενώ προσδιορίστηκαν και στα πλυμένα αιμοπετάλια υπερχοληστερολαιμικών ασθενών που λάμβαναν μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι της PCSK9. Η δράση της recombinant PCSK9 μελετήθηκε τόσο στη συσσώρευση πλυμένων αιμοπεταλίων όσο και στην ενδοθηλιακή λειτουργία σε ενδοθηλιακά κύτταρα HUVECs ως προς τη μεμβρανική έκφραση του ICAM-1 και την έκκριση της MCP-1. Στα παραπάνω συστήματα μελετήθηκε και η δράση της συνδεδεμένης PCSK9 στην LDL και HDL λιποπρωτεΐνη χρησιμοποιώντας αντίσωμα έναντι της PCSK9. Προκειμένου να διερευνήσουμε πιθανές πλειοτροπικές δράσεις των μονοκλωνικών αντισωμάτων που χορηγούνται έναντι της PCSK9, μελετήθηκε η συσσώρευση των αιμοπεταλίων των υπερχοληστερολαιμικών ασθενών τόσο στο PRP όσο και στα πλυμένα αιμοπετάλια πριν και μετά από 4 δόσεις του αντισώματος. Επιπλέον στο PRP των ασθενών προσδιορίσαμε τη μεμβρανική έκφραση της P-σελεκτίνης και του CD40L στις δύο παραπάνω χρονικές στιγμές. Στη συνέχεια, στους ασθενείς αυτούς προσδιορίσαμε τις αλληλεπιδράσεις των αιμοπεταλίων με τα CD34+ πρόδρομα κύτταρα σε ολικό αίμα με κυτταρομετρία ροής. Τέλος, διερευνήθηκε η ικανότητα τόσο της recombinant όσο και της συνδεδεμένης στην HDL και LDL PCSK9, στην αγγειογένεση μέσω του σχηματισμού αυλών σε κύτταρα HUVECs.Αποτελέσματα: Οι απομονωμένες υπερφυγοκεντρικά λιποπρωτεΐνες περιέχουν PCSK9, δείχνοντας ότι λόγω υπερφυγοκέντρησης ένα μέρος της PCSK9 αποσυνδέεται από τα λιποπρωτεϊνικά σωματίδια. Η κατανομή στα σωματίδια της HDL έδειξε ότι τα S-HDL διαθέτουν περισσότερη PCSK9 ενώ στην HDL υπάρχουν και οι δυο μορφές της PCSK9 (ώριμη και furin-cleaved μορφή). Τα πλυμένα αιμοπετάλια τόσο των ασθενών όσο και τον νορμολιπιδαιμικών διαθέτουν και τις δυο μορφές PCSK9 ενώ η ενδογενής PCSK9 δεν επηρεάζει την συσσώρευση των αιμοπεταλίων. H recombinant PCSK9 ενισχύει τη συσσώρευση των αιμοπεταλίων που επάγεται από θρομβίνη και αραχιδονικό οξύ ενώ μόνη της δεν επάγει τη συσσώρευση. Επίσης, οι LDL και HDL αναστέλλουν τη συσσώρευση των αιμοπεταλίων. Επιπλέον, τα μονοκλωνικά αντισώματα έναντι της PCSK9 σε ασθενείς που τα λαμβάνουν δεν τροποποιήσαν στατιστικά σημαντικά την συσσώρευση των αιμοπεταλίων πριν και μετά το αντίσωμα τόσο σε PRP όσο και σε πλυμένα αιμοπετάλια, καθώς επίσης και τη μεμβρανική έκφραση της P-σελεκτίνης και του CD40L. Όμως τα πλυμένα αιμοπετάλια μετά την χορήγηση του αντισώματος περιέχουν περισσότερη PCSK9. Επιπλέον, στα ενδοθηλιακά κύτταρα HUVECs η PCSK9 ενισχύει τη μεμβρανική έκφραση του ICAM-1 που επάγεται από τον TNF-α καθώς και την έκκριση της MCP-1. Παράλληλα, οι LDL και HDL ανέστειλαν τη μεμβρανική έκφραση του ICAM-1 ενώ παρουσία αντισώματος έναντι της PCSK9 η αναστολή αυτή μειώθηκε στατιστικά σημαντικά υποδηλώνοντας τη συμμετοχή της PCSK9 των λιποπρωτεϊνών σε αυτό, ενώ αναφορικά με την MCP-1 οι λιποπρωτεΐνες προκάλεσαν επαγωγή της έκκρισης του. Επιπλέον, η recombinant PCSK9 ενίσχυσε τη δημιουργία αυλών ενώ οι HDL και LDL ανέστειλαν τη δημιουργία αυλών που επάγεται από VEGF. Τέλος, στους ασθενείς υπό μονοκλωνικά αντισώματα έναντι της PCSK9 υπήρξε αύξηση του ενδοθηλιακού φαινοτύπου των CD34+πρόδρομων κυττάρων και των αλληλεπιδράσεων των αιμοπεταλίων με τα CD34+ πρόδρομα κύτταρα. Συμπεράσματα: Η παρούσα διδακτορική διατριβή δείχνει ότι η PCSK9 πέραν του κλασσικού ρόλου της στην αποικοδόμηση του LDL υποδοχέα και την αύξηση της LDL χοληστερόλης στο πλάσμα, εμπλέκεται σε διάφορους μηχανισμούς αθηροθρόμβωσης όπως είναι η συσσώρευση των αιμοπεταλίων, η μεμβρανική έκφραση του μορίου προσκόλλησης ICAM-1 καθώς και η έκκριση της MCP-1, λειτουργίες που αποδεικνύουν την συμβολή της στη θρόμβωση και τη φλεγμονή, ενώ παράλληλα εμφανίζει και αγγειογενετικές δράσεις συμβάλλοντας στην ενδοθηλιακή αναγέννηση. Επίσης, λόγω των λιποπρωτεϊνικών σωματιδίων που διαθέτουν PCSK9 φαίνεται και η εμπλοκή της PCSK9 στην αθηροσκλήρωση. Επιπροσθέτως, η εργασία μας απέδειξε ότι τα μονοκλωνικά αντισώματα έναντι της PCSK9 πέραν του βασικού τους ρόλου, εμπλέκονται στη λειτουργικότητα των αιμοπεταλίων των ασθενών και βασικότερα στον ενδοθηλιακό φαινότυπο των CD34+ κυττάρων καθώς και στις αλληλεπιδράσεις τους με τα αιμοπετάλια.
Background-Purpose: PCSK9 is a serine protease which, in addition to its major role in endosomal and lysosomal degradation of the LDL receptor, which results in increased plasma LDL-cholesterol levels, exhibits several LDL receptor-independent actions on a variety of cell types, including platelets. Recent studies have demonstrated that PCSK9 is involved in the pathophysiology of inflammation and shows actions on other cell types, such as platelets, monocytes, etc. Materials-Methods: Initially, the interaction of PCSK9 with plasma lipoproteins was studied by isolating them by sequential ultracentrifugation and determining their PCSK9 levels by ELISA. At the same time, we studied the distribution of PCSK9 in HDL lipoprotein particles by the Lipoprint system and the form of PCSK9 present in each lipoprotein was determined by the Western blotting method. To investigate the effect of PCSK9 on thrombosis, we determined the levels of endogenous PCSK9 in washed platelets isolated from normolipidemic donors and also determined in washed platelets from hypercholesterolemic patients receiving monoclonal antibody against PCSK9. The effect of recombinant PCSK9 was studied both on the accumulation of washed platelets and on endothelial function in HUVECs endothelial cells in terms of membrane expression of ICAM-1 and secretion of MCP-1. In the above systems, the effect of bound PCSK9 on LDL and HDL lipoprotein was also studied using an antibody against PCSK9. To investigate possible pleiotropic actions of monoclonal antibodies administered against PCSK9, platelet aggregation of hypercholesterolemic patients in both PRP and washed platelets was studied before and after 4 doses of the antibody. In addition, in the PRP of the patients we determined the membrane expression of P-selectin and CD40L at the above two time points. We then determined in these patients the interactions of platelets with CD34+ precursor cells in whole blood by flow cytometry. Finally, we investigated the ability of both recombinant and HDL- and LDL-associated PCSK9 to angiogenesis through lumen formation in HUVECs cells.Results: Ultracentrifugally isolated lipoproteins contain PCSK9, indicating that due to ultracentrifugation a portion of PCSK9 is uncoupled from the lipoprotein particles. The distribution in HDL particles showed that S-HDL possesses more PCSK9 while in HDL both forms of PCSK9 (mature and furin-cleaved form) are present. The washed platelets of both patients and normolipidemics contain both forms of PCSK9 while endogenous PCSK9 does not affect platelet aggregation. Recombinant PCSK9 enhances platelet aggregation induced by thrombin and arachidonic acid while alone does not induce platelet aggregation. Also, LDL and HDL inhibit platelet aggregation. In addition, monoclonal antibodies against PCSK9 in patients receiving them did not statistically significantly modify platelet aggregation before and after the antibody in both PRP and washed platelets, as well as membrane expression of P-selectin and CD40L. However, washed platelets after antibody administration contain more PCSK9. In addition, in HUVECs endothelial cells PCSK9 enhances TNF-α-induced membrane expression of ICAM-1 as well as MCP-1 secretion. In parallel, LDL and HDL inhibited the membrane expression of ICAM-1 while in the presence of an antibody against PCSK9 this inhibition was statistical significantly reduced suggesting the involvement of PCSK9 of lipoproteins in this, whereas with respect to MCP-1 lipoproteins induced its secretion. Furthermore, recombinant PCSK9 enhanced lumen formation whereas HDL and LDL inhibited VEGF-induced lumen formation. Finally, in patients under monoclonal antibodies against PCSK9 there was an increase in the endothelial phenotype of CD34+ precursor cells and platelet interactions with CD34+ precursor cells.Conclusions: This PhD thesis shows that PCSK9 in addition to its classical role in LDL receptor degradation and LDL cholesterol increase in plasma, is involved in various mechanisms of atherothrombosis such as platelet aggregation, membrane expression of the adhesion molecule ICAM-1 and secretion of MCP-1, functions that demonstrate its contribution to thrombosis and inflammation, while it also displays angiogenic actions contributing to endothelial regeneration. Also, due to the lipoprotein particles containing PCSK9, the involvement of PCSK9 in atherosclerosis is also shown. In addition, our work demonstrated that monoclonal antibodies against PCSK9, in addition to their main role, are involved in the platelet functionality of patients and more fundamentally in the endothelial phenotype of CD34+ cells and their interactions with platelets.
Background-Purpose: PCSK9 is a serine protease which, in addition to its major role in endosomal and lysosomal degradation of the LDL receptor, which results in increased plasma LDL-cholesterol levels, exhibits several LDL receptor-independent actions on a variety of cell types, including platelets. Recent studies have demonstrated that PCSK9 is involved in the pathophysiology of inflammation and shows actions on other cell types, such as platelets, monocytes, etc. Materials-Methods: Initially, the interaction of PCSK9 with plasma lipoproteins was studied by isolating them by sequential ultracentrifugation and determining their PCSK9 levels by ELISA. At the same time, we studied the distribution of PCSK9 in HDL lipoprotein particles by the Lipoprint system and the form of PCSK9 present in each lipoprotein was determined by the Western blotting method. To investigate the effect of PCSK9 on thrombosis, we determined the levels of endogenous PCSK9 in washed platelets isolated from normolipidemic donors and also determined in washed platelets from hypercholesterolemic patients receiving monoclonal antibody against PCSK9. The effect of recombinant PCSK9 was studied both on the accumulation of washed platelets and on endothelial function in HUVECs endothelial cells in terms of membrane expression of ICAM-1 and secretion of MCP-1. In the above systems, the effect of bound PCSK9 on LDL and HDL lipoprotein was also studied using an antibody against PCSK9. To investigate possible pleiotropic actions of monoclonal antibodies administered against PCSK9, platelet aggregation of hypercholesterolemic patients in both PRP and washed platelets was studied before and after 4 doses of the antibody. In addition, in the PRP of the patients we determined the membrane expression of P-selectin and CD40L at the above two time points. We then determined in these patients the interactions of platelets with CD34+ precursor cells in whole blood by flow cytometry. Finally, we investigated the ability of both recombinant and HDL- and LDL-associated PCSK9 to angiogenesis through lumen formation in HUVECs cells.Results: Ultracentrifugally isolated lipoproteins contain PCSK9, indicating that due to ultracentrifugation a portion of PCSK9 is uncoupled from the lipoprotein particles. The distribution in HDL particles showed that S-HDL possesses more PCSK9 while in HDL both forms of PCSK9 (mature and furin-cleaved form) are present. The washed platelets of both patients and normolipidemics contain both forms of PCSK9 while endogenous PCSK9 does not affect platelet aggregation. Recombinant PCSK9 enhances platelet aggregation induced by thrombin and arachidonic acid while alone does not induce platelet aggregation. Also, LDL and HDL inhibit platelet aggregation. In addition, monoclonal antibodies against PCSK9 in patients receiving them did not statistically significantly modify platelet aggregation before and after the antibody in both PRP and washed platelets, as well as membrane expression of P-selectin and CD40L. However, washed platelets after antibody administration contain more PCSK9. In addition, in HUVECs endothelial cells PCSK9 enhances TNF-α-induced membrane expression of ICAM-1 as well as MCP-1 secretion. In parallel, LDL and HDL inhibited the membrane expression of ICAM-1 while in the presence of an antibody against PCSK9 this inhibition was statistical significantly reduced suggesting the involvement of PCSK9 of lipoproteins in this, whereas with respect to MCP-1 lipoproteins induced its secretion. Furthermore, recombinant PCSK9 enhanced lumen formation whereas HDL and LDL inhibited VEGF-induced lumen formation. Finally, in patients under monoclonal antibodies against PCSK9 there was an increase in the endothelial phenotype of CD34+ precursor cells and platelet interactions with CD34+ precursor cells.Conclusions: This PhD thesis shows that PCSK9 in addition to its classical role in LDL receptor degradation and LDL cholesterol increase in plasma, is involved in various mechanisms of atherothrombosis such as platelet aggregation, membrane expression of the adhesion molecule ICAM-1 and secretion of MCP-1, functions that demonstrate its contribution to thrombosis and inflammation, while it also displays angiogenic actions contributing to endothelial regeneration. Also, due to the lipoprotein particles containing PCSK9, the involvement of PCSK9 in atherosclerosis is also shown. In addition, our work demonstrated that monoclonal antibodies against PCSK9, in addition to their main role, are involved in the platelet functionality of patients and more fundamentally in the endothelial phenotype of CD34+ cells and their interactions with platelets.
Περιγραφή
Λέξεις-κλειδιά
Αθηροσκλήρωση, Αθηροθρόμβωση, PCSK9, Ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα ομφάλιου λώρου, Αιμοπετάλια, Υψηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνη, Χαμηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνη, Υπερχοληστερολαιμία, Μονοκλωνικά αντισώματα έναντι της PCSK9, Φλεγμονή
Θεματική κατηγορία
Χημεία, Ιατρική Βιοχημεία
Παραπομπή
Σύνδεσμος
Γλώσσα
el
Εκδίδον τμήμα/τομέας
Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων. Σχολή Θετικών Επιστημών. Τμήμα Χημείας
Όνομα επιβλέποντος
Τσελέπης, Αλέξανδρος
Εξεταστική επιτροπή
Λυμπερόπουλος, Ευάγγελος
Τζίμας, Πέτρος
Κούκκου, Άννα-Ειρήνη
Κυπραίος, Κυριάκος
Μηλιώνης, Χαράλαμπος
Μπαϊρακτάρη, Ελένη
Τσελέπης, Αλέξανδρος
Τζίμας, Πέτρος
Κούκκου, Άννα-Ειρήνη
Κυπραίος, Κυριάκος
Μηλιώνης, Χαράλαμπος
Μπαϊρακτάρη, Ελένη
Τσελέπης, Αλέξανδρος
Γενική Περιγραφή / Σχόλια
Ίδρυμα και Σχολή/Τμήμα του υποβάλλοντος
Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων. Σχολή Θετικών Επιστημών
Πίνακας περιεχομένων
Περιεχόμενα
Σκοπός της Διατριβής 14
1ο Κεφάλαιο – Αθηροθρόμβωση 17
1.1 Εισαγωγή 17
1.2 Αιμοπετάλια 17
1.2.1 Δομή των αιμοπεταλίων 18
1.2.1.1 Περιφερική ζώνη 18
1.2.1.2 Κυτοσόλιο 19
1.2.1.3 Ζώνη των οργανιδίων 19
1.2.1.4 Συστήματα μεμβρανών 21
1.3 Υποδοχείς των αιμοπεταλίων και οι αγωνιστές τους 21
1.3.1 Υποδοχείς των αιμοπεταλίων 21
1.3.1.1 Υποδοχείς προσκόλλησης 22
1.3.1.1.2 Υποδοχέας GPVI 22
1.3.1.1.3 Υποδοχέας GPIa/IIa 23
1.3.1.1.4 Υποδοχέας GPIb/IX/V 24
1.3.1.2 Πουρινεργικοί υποδοχείς 24
1.3.1.3 Υποδοχείς του θρομβοξανίου Α2 26
1.3.1.4. Υποδοχέας GPIIb/IIIa 27
1.3.1.5. Υποδοχείς ενεργοποιούμενοι από πρωτεάσες 28
1.4 Προσκόλληση, Ενεργοποίηση και Συσσώρευση Αιμοπεταλίων 29
1.5 Ενδοθήλιο 32
1.5.1 Χαρακτηρισμός, ταυτοποίηση και ταξινόμηση των EPCs 33
1.5.2. Τα EPCs στην αθηροσκλήρωση 37
1.5.3 Τα EPCs στην αγγειογένεση 38
1.5.4 Τα EPCs στην αναγέννηση του ενδοθηλίου 40
1.5.5. Αλληλεπιδράσεις μεταξύ αιμοπεταλίων και των EPCs 41
1.5.6 Αλληλεπιδράσεις μεταξύ των αιμοπεταλίων και των πρόδρομων CD34+ κυττάρων 42
1.6. Λιποπρωτεΐνες 43
1.6.1 HDL λιποπρωτεΐνη 45
1.6.2 LDL λιποπρωτεΐνη 46
1.6.3 Λιποπρωτεϊνικοί Υποδοχείς 47
1.7 Αντιαιμοπεταλιακή αγωγή 50
1.7.1. Αναστολείς της COX-1 51
1.7.2 Ανταγωνιστές του υποδοχέα P2Y12 53
1.7.3 Ανταγωνιστές των PARs 55
1.8 Υπολιπιδαιμική αγωγή 57
1.8.1 Στατίνες 57
1.8.2 Φιμπράτες 58
2ο Κεφάλαιο ~ Proprotein Convertases 59
2.1 Εισαγωγή 59
2.2 PCSK9 ~Εισαγωγή 61
2.3 Βιοχημεία και Μοριακή Βιολογία της PCSK9 62
2.4 Αλληλεπιδράσεις της PCSK9 με λιποπρωτεΐνες 64
2.4.1 Αλληλεπιδράσεις της PCSK9 με την LDL λιποπρωτεΐνη 64
2.4.2 Αλληλεπιδράσεις της PCSK9 με λιποπρωτεΐνες πλούσιες σε τριγλυκερίδια 66
2.4.3 Αλληλεπιδράσεις της PCSK9 με την Lp(a) 66
2.4.4 Αλληλεπιδράσεις της PCSK9 με την HDL λιποπρωτεΐνη 67
2.5 Θεραπείες που στοχεύουν την PCSK9 67
2.5.1. Αναστολείς της σύνδεσης της PCSK9 με τον υποδοχέα της LDL 68
2.5.1.1. Μονοκλωνικά αντισώματα έναντι της PCSK9 68
2.5.1.2. Εμβόλια έναντι της PCSK9 70
2.5.1.3. Μιμητικά πεπτίδια έναντι της PCSK9 71
2.5.1.4. Αδνεκτίνες 71
2.5.1.5. Ανεξίνη Α2 72
2.5.2. Αναστολείς της έκφρασης της PCSK9 72
2.5.2.1 siRNA για τη σίγαση του γονιδίου της ηπατικής PCSK9 72
2.5.2.2 Ολιγονουκλεοτίδια έναντι του mRNA της PCSK9 (Antisense Oligonucleotides) 73
2.5.2.3 Χρησιμότητα της τεχνολογίας CRISPR/Cas9 στην τροποποίηση του γονιδιώματος της PCSK9 74
2.5.3. Αναστολείς της έκκρισης της PCSK9 75
2.5.4 Πλειοτροπικές δράσεις της αναστολής της PCSK9 76
2.6 Ο ρόλος της PCSK9 στην αθηροσκλήρωση και τη θρόμβωση 76
3ο Κεφάλαιο ~Υλικά και Μέθοδοι 80
3.1 Απομόνωση Λιποπρωτεϊνών με τη μέθοδο των διαδοχικών υπερφυγοκεντρήσεων 81
3.1.1. Καταβύθιση των ApoB- Λιποπρωτεϊνών 85
3.2 Προσδιορισμός πρωτεϊνών με τη μέθοδο BCA 86
3.3 Ενζυμικός Φωτομετρικός Προσδιορισμός Ολικής Χοληστερόλης 88
3.4 Μελέτη της καθαρότητας των απομονωμένων λιποπρωτεϊνών καθώς και του απεμπλουτισμένου από ApoB- λιποπρωτεϊνών υπερκειμένου με ηλεκτροφόρηση των δειγμάτων 90
3.5 Συσσωρευομετρία Οπτικής Διαπερατότητας (Light Transmittance Aggregometry) 93
3.5.1. Παρασκευή πλάσματος πλούσιου σε αιμοπετάλια (Platelet-Rich Plasma, PRP) 94
3.5.2 Παρασκευή πλυμένων αιμοπεταλίων κατά Mustard 97
3.5.2.1. Λύση πλυμένων αιμοπεταλίων 100
3.5.3 Ρύθμιση και χρήση του οργάνου 101
3.6 Κυτταρομετρία Ροής (Flow Cytometry) 103
3.6.1. Έλεγχος της εμφάνισης του ενδοθηλιακού φαινότυπου στα CD34+ πρόδρομα κύτταρα καθώς και στην αλληλεπίδραση των αιμοπεταλίων με τα CD34+ και CD34+/KDR+ κύτταρα. 104
3.6.2 Έλεγχος ενεργοποίησης αιμοπεταλίων με έκφραση της P-σελεκτίνης και του CD40L. 106
3.6.3 Πειραματική Πορεία-Ρύθμιση του οργάνου 107
3.7 Κυτταρική Καλλιέργεια Ενδοθηλιακών Κυττάρων Ομφάλιου Λώρου 108
3.7.1 Πειραματική Πορεία- Μελέτη της επίδρασης της PCSK9 και των λιποπρωτεϊνών στη μεμβρανική έκφραση του ICAM-1 σε ενδοθηλιακά κύτταρα HUVECs. 110
3.8 Αγγειογένεση 112
3.8.1. Πειραματική Πορεία- Μελέτη της δράσης της PCSK9 και των λιποπρωτεϊνών στον σχηματισμό κυτταρικών αυλών 114
3.9 Ανοσοαποτύπωση (Western blotting) 116
3.9.1 Προετοιμασία δειγμάτων 116
3.9.2 Ηλεκτροφόρηση Πρωτεϊνών 117
3.9.3 Πηκτή διαχωρισμού και Πηκτή Επιστοίβαξης 119
3.9.4 Διαλύματα ηλεκτροφόρησης - Ηλεκτροφορητικός διαχωρισμός πρωτεϊνικών δειγμάτων 123
3.9.5 Ηλεκτρομεταφορά Πρωτεϊνών σε Μεμβρανικό Υπόστρωμα 127
3.9.6. Αποτύπωση με την τεχνική της ενισχυμένης χημειοφωταύγειας 130
3.9.7. Επώαση μεμβρανών με αντισώματα 131
3.9.8. Αποτύπωση πρωτεϊνών 133
3.10 Μεθοδολογία ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) 136
3.10.1 Ανοσοενζυμικός προσδιορισμός της PCSK9 136
3.10.2 Ανοσοενζυμικός προσδιορισμός της HDL 138
3.10.3 Ανοσοενζυμικός προσδιορισμός της συνδεδεμένης με την HDL PCSK9 140
3.10.4 Ανοσοενζυμικός προσδιορισμός του MCP-1 141
3.11 Lipoprint System 143
3.12 Στατιστική Ανάλυση 145
4ο Κεφάλαιο ~Αποτελέσματα 146
4.1 Αλληλεπίδραση της PCSK9 με τις λιποπρωτεΐνες του πλάσματος 146
4.2 Βιοχημικά και Δημογραφικά Χαρακτηριστικά των ασθενών πριν και μετά την χορήγηση του αντισώματος. 149
4.3 Η δράση της PCSK9 στα αιμοπετάλια 153
4.3.1 Προσδιορισμός PCSK9 σε πλυμένα αιμοπετάλια 153
4.3.2 Η δράση της PCSK9 στη συσσώρευση των πλυμένων αιμοπεταλίων 155
4.3.3 Η δράση της συνδεδεμένης PCSK9 στην LDL και στην HDL λιποπρωτεΐνη στη συσσώρευση των πλυμένων αιμοπεταλίων 158
4.3.4 Μελέτη της λειτουργικότητας των αιμοπεταλίων in vivo στους ασθενείς της 1ης Ομάδας του πληθυσμού της μελέτης. 159
4.4 Η δράση της PCSK9 στην ενεργοποίηση των ενδοθηλιακών κυττάρων (HUVECs). 163
4.4.1. Η δράση της PCSK9 στη μεμβρανική έκφραση του ICAM-1 163
4.4.2. Η δράση της recombinant PCSK9 στην ενεργοποίηση των ενδοθηλιακών κυττάρων (HUVECs). Στην έκκριση του MCP-1 στα ενδοθηλιακά κύτταρα 166
4.4.3 Η δράση της συνδεδεμένης PCSK9 στην LDL και στην HDL λιποπρωτεΐνη στην ενεργοποίηση των ενδοθηλιακών κυττάρων (HUVECs). Στη μεμβρανική έκφραση του ICAM-1 στα ενδοθηλιακά κύτταρα 167
4.4.4 Η δράση της συνδεδεμένης PCSK9 στην LDL και στην HDL λιποπρωτεΐνη στην ενεργοποίηση των ενδοθηλιακών κυττάρων (HUVECs). Στην έκκριση του MCP-1 στα ενδοθηλιακά κύτταρα 168
4.5 Η δράση της PCSK9 στην αγγειογένεση των ενδοθηλιακών κυττάρων HUVECs. 170
4.5.1. Η δράση της recombinant PCSK9 στην αγγειογένεση με τη μέθοδο Matrigel 170
4.5.2. Η δράση της συνδεδεμένης PCSK9 στην LDL και στην HDL λιποπρωτεΐνη στην αγγειογένεση με τη μέθοδο Matrigel 171
4.6 Επίδραση των μονοκλωνικών αντισωμάτων στην αλληλεπίδραση των κυκλοφορούντων CD34+ πρόδρομων κυττάρων με τα αιμοπετάλια. 172
5ο Κεφάλαιο ~ Συζήτηση 175
6ο Κεφάλαιο ~ Βιβλιογραφικές Αναφορές 179
Περίληψη 218
Abstract 221
Δημοσιεύσεις-Διακρίσεις 223
Χορηγός
Βιβλιογραφική αναφορά
Ονόματα συντελεστών
Αριθμός σελίδων
226 σ.