Βελτιστοποίηση μεθόδου εκχύλισης QuEChERS σε συνδυασμό με φασματογράφο μαζών υψηλής διακριτικής ικανότητας UHPLC-LTQ/Obitrap MS για τον προσδιορισμό επιλεγμένων υπολειμμάτων φυτοφαρμάκων σε γύρη μέλισσας
Φόρτωση...
Ημερομηνία
Συγγραφείς
Τυροπώλης, Ιωάννης
Τίτλος Εφημερίδας
Περιοδικό ISSN
Τίτλος τόμου
Εκδότης
Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων. Σχολή Θετικών Επιστημών. Τμήμα Χημείας
Περίληψη
Τύπος
Είδος δημοσίευσης σε συνέδριο
Είδος περιοδικού
Είδος εκπαιδευτικού υλικού
Όνομα συνεδρίου
Όνομα περιοδικού
Όνομα βιβλίου
Σειρά βιβλίου
Έκδοση βιβλίου
Συμπληρωματικός/δευτερεύων τίτλος
Περιγραφή
Η διατροφική και βιολογική αξία των μελισσοκομικών προϊόντων έχει προκαλέσει ιδιαίτερο
ενδιαφέρον τις τελευταίες δεκαετίες ενώ κάποια από αυτά (γύρη, βασιλικός πολτός, πρόπολη)
έχουν χαρακτηριστεί ως υπερτροφές. Επιπλέον, έχουν χρησιμοποιηθεί σε μεγάλο βαθμό ως πρώτες
ύλες για την παραγωγή λειτουργικών τροφίμων αλλά και καλλυντικών και φαρμακευτικών
προϊόντων. [1]. Η παρουσία υπολειμμάτων φυτοφαρμάκων σε αυτά τα προϊόντα είναι ένα
φαινόμενο που συνδέεται με την ευρεία εφαρμογή τους στο πεδίο, προκειμένου να βοηθήσουν τους
καλλιεργητές να ανταποκριθούν στις ανάγκες και τις προσδοκίες της αγοράς. Η ευαισθητοποίηση
για το παραπάνω θέμα δεν περιορίζεται μόνο στο πλαίσιο της ασφάλειας των τροφίμων αλλά και
σε ένα φαινόμενο που ονομάζεται Διαταραχή Κατάρρευσης Αποικιών ή Colony Collapse Disorder
(CCD), που εισήχθη για πρώτη φορά το 2007 ως η επίσημη περιγραφή ενός φαινομένου στο οποίο
πολλές αποικίες μελισσών εξαφανίστηκαν το χειμώνα και την άνοιξη του 2006-2007 στις ΗΠΑ,
ενώ το ίδιο φαινόμενο έλαβε χώρα και σε διάφορες χώρες της Ευρώπης. [2]. Τα χαρακτηριστικά
αυτού του φαινομένου είναι η ξαφνική εξαφάνιση των ενήλικων μελισσών από αποικίες σε κυψέλες
κατά τις οποίες δεν βρέθηκαν νεκρές μέλισσες, ενώ νεαρές μέλισσες, μέλι και "ψωμί" μέλισσας
έμειναν ακόμα στο μελίσσι. Τα φυτοφάρμακα , μεταξύ άλλων , προτάθηκαν ως πιθανή αιτία αυτού
του περιστατικού. [3].
Η ρύπανση από φυτοφάρμακα στο περιβάλλον της κυψέλης μπορεί να συμβεί με άμεσο και
έμμεσο τρόπο. Οι μελισσοκόμοι χρησιμοποιούν άμεσα ακαρεοκτόνα όπως τα amitraz, tau-
fluvalinate, coumaphos και malathion για να αντιμετωπίσουν το εξωτερικό ακάρεο Varroa. [4].
Επιπλέον, κάθε φορά που μια μέλισσα προσγειώνεται σε ένα άνθος για να συλλέξει γύρη και νέκταρ
υπάρχει η πιθανότητα να έρθει σε επαφή και με φυτοφάρμακα που ψεκάζονται στις ανθοφόρες
καλλιέργειες. Λαμβάνοντας επίσης υπόψη την ικανότητα των μελισσών να πετούν σε εμβέλεια έως
και 7 χιλιόμετρα γύρω από την κυψέλη, είναι πολύ εύκολο αυτές να μεταφέρουν έμμεσα
υπολείμματα φυτοφαρμάκων στην κυψέλη. Αυτός είναι επίσης ένας λόγος για τον οποίο οι
μέλισσες και τα προϊόντα τους χαρακτηρίζονται ως βιοδείκτες για τη ρύπανση του περιβάλλοντος
από φυτοφάρμακα. [5].
Ειδικά η γύρη των μελισσών θεωρείται σημαντικός βιοδείκτης περιβαλλοντικής επιμόλυνσης
λόγω του τρόπου συλλογής της. Όπως αναφέρθηκε παραπάνω, οι μέλισσες συλλέγουν γύρη όταν
προσγειώνονται σε ένα άνθος, αργότερα αυτή η γύρη αναμιγνύεται με νέκταρ ή μέλι και αδενικές
εκκρίσεις για καλύτερη συνοχή και η γύρη των μελισσών σχηματίζεται και αποθηκεύεται στα κελιά
της κηρήθρας για να εκθρέψει τον γόνο. Το χρώμα της γύρης των μελισσών εξαρτάται από το άνθος
από το οποίο συλλέχθηκαν. [6]. Η γύρη των μελισσών είναι επίσης μια κύρια πηγή τροφής για τις
μέλισσες, πράγμα που σημαίνει ότι τα φυτοφάρμακα που μπορεί να υπάρχουν σε αυτήν μπορούν
να μεταφερθούν στα υπόλοιπα προϊόντα μελισσών. [1]. Η θρεπτική αξία της γύρης των μελισσών
έχει επίσης αναγνωριστεί ως «η τέλεια τροφή» για τον άνθρωπο λόγω της παρουσίας
μακροθρεπτικών συστατικών όπως πρωτεΐνες, υδατάνθρακες, με τη μορφή σακχάρων και φυτικών
ινών, και λίπη αλλά και μικροθρεπτικά συστατικά όπως φλαβονοειδή, καροτενοειδή, μέταλλα και
βιταμίνες. [1], [6]. Τα γενικά οφέλη για την υγεία, όπως οι αντιοξειδωτικές και αντιφλεγμονώδεις
ιδιότητες που έχει η γύρη των μελισσών, αποδίδονται στα παραπάνω συστατικά. [7]
Εκτός από το περιβαλλοντικό ενδιαφέρον και το ενδιαφέρον της αγοράς για τη γύρη των
μελισσών, τα ανώτατα όρια καταλοίπων, Maximum Residues Limits, (MRLs) για τα φυτοφάρμακα
στη γύρη δεν έχουν θεσπιστεί από την ΕΕ.[8] Η επικύρωση μιας κατάλληλης αναλυτικής
μεθοδολογίας για τον έλεγχο και τον ποσοτικό προσδιορισμό των υπολειμμάτων φυτοφαρμάκων
στη γύρη των μελισσών είναι ζωτικής σημασίας. Μέσα από τη βιβλιογραφία η εφαρμογή μιας
μεθόδου εκχύλισης QuEChERS που προτάθηκε για πρώτη φορά από τους Anastassiades et al [9]
χρησιμοποιείται ευρέως σε συνδυασμό με τεχνικές χρωματογραφίας GC-MS αλλά κυρίως LC-MS.
[10]. Υπάρχουν πολλές προκλήσεις στην ανάλυση της γύρης των μελισσών και χαρακτηρίζεται ως
πολύ απαιτητικό υπόστρωμα λόγω της πολύπλοκης σύνθεσής της. Η χαμηλή περιεκτικότητα της
γύρης σε νερό (5 – 10%) έχει ως αποτέλεσμα σημαντική και άμεση επίδραση των διάφορων
ενώσεων που περιέχονται σε αυτή στην ανάλυση. Περαιτέρω ζητήματα προκύπτουν διότι η γύρη
που συλλέγεται από τις μέλισσες συνήθως προέρχεται από μια ποικιλία διαφορετικών φυτών που
συνδυάζονται μαζί όταν εισάγονται στην αγορά προς πώληση. Αυτός ο πιθανός συνδυασμός
ανόμοιας και ποικίλης συγκέντρωσης ενώσεων και χαμηλής περιεκτικότητας σε νερό μπορεί να
επηρεάσει σημαντικά την ανάλυση των φυτοφαρμάκων στη γύρη. [11]
Πιο συγκεκριμένα, στην υγρή χρωματογραφική ανάλυση σε συνδυασμό με δίδυμη
φασματομετρία μάζας (LC-MS/MS), για παράδειγμα, η μήτρα γύρης των μελισσών επηρεάζει την
αποτελεσματικότητα ιονισμού των αναλυτών στην πηγή του φασματόμετρου μάζας
χρησιμοποιώντας ιονισμό ηλεκτροψεκασμού ή χημικό ιονισμό ατμοσφαιρικής πίεσης. Γενικά η
απόδοση ιονισμού είναι συνάρτηση διαφόρων συστατικών όπως οι αναλυτές ουσίες, τα συστατικά
μήτρας, η τεχνική ιονισμού, η θερμοκρασία, η τάση και η πηγή έκλουσης. [11] Στην παρούσα
μελέτη βελτιστοποιήθηκε και εφαρμόσθηκε μια μεθοδολογία εκχύλισης QuEChERS σε
συνδυασμό με υγρή χρωματογραφία υπερύψηλής απόδοσης συζευγμένη με τροχιακό αναλυτή
μαζών Orbitrap σε γύρη μελισσών για τον έλεγχο και τον ποσοτικό προσδιορισμό υπολειμμάτων
φυτοφαρμάκων. Ως καταλληλότερη μέθοδος εκχύλισης προέκυψε μία παραλλαγή του προτύπου
ΕΝ 15662 όπου γίνεται χρήση κιτρικών αλάτων. Tο στάδιο του καθαρισμού βελτιστοποιήθηκε με
την χρήση συνδιασμού PSA, C18 και z-Sep+ με την προσθήκη ενός ενδιάμεσου σταδίου ψύξης. Τα
όρια ποσοτικοποίησης MQLs της μεθόδου βρέθηκαν να κυμαίνονται από 5μg/Kg για ενώσεις όπως
το atrazine και diazinon έως 54.4μg/Kg για τα clothianidin και (z) – Mevinphos εξαίρεση το
chlorpyrifos του οποίου το όριο ποσοτικοποίησης είναι 99μg/Kg. Συνολικά έγινε επικύρωση της
μεθόδου για 43 διαφορετικές ενώσεις ενώ αναλύθηκαν 11 εμπορικά διαθέσιμα δείγματα γύρης.
Ταυτόχρονα πραγματοποιήθηκε και μια αξιολόγηση των δειγμάτων σε επίπεδο εκτίμησης της
επικινδυνότητας μέσω κατανάλωσης της γύρης απο τον άνθρωπο αλλά και την μέλισσα. Τα
αποτελέσματα παρουσίασαν μία μόνο θετική ανίχνευση στο μυκητοκτόνο pyraclostrobin. Tα
αποτελέσματα της εκτίμησης κινδύνου έδειξαν ανησυχία για την κατανάλωση από τον άνθρωπο
αλλά κανέναν κίνδυνο για την μέλισσα. Ο μικρός αριθμός δειγμάτων γύρης (11) σε συνδυασμό μία
μόνο θετική ανίχνευση δεν αρκούν για την λήψη ενός ασφαλούς συμπεράσματος όσο αναφορά την
εκτίμηση κινδύνου.
The nutritional and biological value of apiculture products has raised a particular interest the past decades while some of them (pollen , royal jelly, propolis ) have been characterized as superfoods. In addition to that they have been vastly used as raw materials for the production of functional foods but also cosmetics and pharmaceuticals.[1]. The presence of pesticides residues in these products is a phenomenon linked at the wide spread application of them at the corps in order to assist the cultivators to match the needs and expectations of the market. The awareness for the matter above is not only limited in the context of food safety but also in a condition called Colony Collapse Disorder or (CCD), first introduced in 2007 as the official description of a syndrome in which many bee colonies died in the winter and spring of 2006–2007 in the USA while the same phenomenon took place also in various countries in Europe.[2]. The characteristics of this phenomenon is the sudden vanishing of adult honey bees from colonies in apiaries. In the same time no dead-bees bodies were found and young immature bees , honey and bee bread were left behind still in the beehive. Pesticides , between others , were proposed as a possible cause of this incident. [3]. Pesticide contamination in the beehive environment can occur in a direct and indirect way. Bee keepers directly use acaricides like amitraz, tau-fluvalinate, coumaphos and malathion in order to address the external acaricide Varroa.[4]. In addition each time a bee lands on a flower in order to collect pollen and nectar there is the possibility of them to be contaminated by pesticides sprayed on the corps nearby. Taking also in consideration the ability of the bees to fly in a range up to 7km around the hive it is very easy of the indirect contamination to occur. That is also a reason why bees and their products are characterized is bio-indicators for the pesticide contamination on the environment.[5]. Bee pollen especially is been considered as an important bio-indicator because of the way it is been collected. As mentioned above bees collect pollen when they land on a flower, later this pollen is been mixed with nectar, wax, enzymes, honey and honeydew and bee pollen is formed as small colored round balls. The color of bee pollen depends on the flower that they were collected from.[6]. Bee pollen is also a main source of food for the bees which means that pesticides that may be present in it can be transferred at the rest bee products. [1]. The nutritional and health value of bee pollen has also been acknowledged and is has been characterized as “the perfect food” for the human because of the presence of macronutrients like proteins , carbohydrates ,in the form of sugars and fiber, and fats and also micronutrients like flavonoids, carotenoids ,minerals and vitamins.[1], [6]. General health benefits like anti-oxidant and anti inflammatory properties found in bee pollen are been ascribed on the components above.[7]. Beside the environmental and market interest for bee pollen, maximum residue limits (MRLs) for pesticides have not been yest established by the EU [12] . The validation of a proper analytical method for the determination of pesticides residues in bee pollen is crucial. Through the literature the application of a Quechers exctraction method first proposed by (Anastassiades et al., 2003) individually modified is widely used in combination with GC-MS but mainly LC-MS chromatographic techniques.[10]. The are a lot of challenges present in the analysis of bee pollen [15] and it is characterized as very challenging beehive matrix because of it’s complex composition. The low water content of pollen (5 – 10%) results to significant and direct influence of its biomolecules to the analysis. Further complication occurs because bee-collected pollen usually is sourced from a variety of different plants that are combined together when they are been released on the market for sale. This possible combination of dissimilar and varying concentration of biomolecules and low water content can significantly interfere with the analysis of pesticides in pollen. [11] More precisely ,in liquid chromatography tandem-mass spectrometry (LC-MS/MS) analysis for example the bee pollen matrix influences the ionization efficiency of analytes in the source of the mass spectrometer using electrospray ionization or atmospheric pressure chemical ionization. In general ionization efficiency is a function of various components like the analytes, the matrix components , the ionization technique, the temperature, the voltage and the elution source.[11] In this study a Quechers method coupled to an LC LTQ/Orbitrap-MS instruments was optimized in order to propose a valid and trustworthy process for the determination and quantification of pesticide residues in bee pollen. During the process the EN 15662 variation of QuEChERS method, using citrate salts, was proposed as the best extraction option . The clean-up step was optimized using a combination of PSA, C18 and z-Sep+ clean up salts with the addition of a freezing step. The method quantification limits MQLs ranged between 5μg/Kg for compounds like atrazine and diazinon and 54.4μg/Kg for clothianidin and (z) – Mevinphos except chlorpyrifos with MQL = 99μg/Kg. The method was validated for 43 compounds in total and it was applied on 11 commercially available bee pollen samples. Meanwhile the results were evaluated through a risk assessment for human consumption and bees. The results showed only one positive detection for the fungicide pyraclostrobin in one sample. The risk assessment results show notable risk for the human consumption but no risk was determined for bees. The small amount of pollen samples (11) in addition to the one only positive detection were not adequate for the extraction of a safe conclusion considering the risk assessment.
The nutritional and biological value of apiculture products has raised a particular interest the past decades while some of them (pollen , royal jelly, propolis ) have been characterized as superfoods. In addition to that they have been vastly used as raw materials for the production of functional foods but also cosmetics and pharmaceuticals.[1]. The presence of pesticides residues in these products is a phenomenon linked at the wide spread application of them at the corps in order to assist the cultivators to match the needs and expectations of the market. The awareness for the matter above is not only limited in the context of food safety but also in a condition called Colony Collapse Disorder or (CCD), first introduced in 2007 as the official description of a syndrome in which many bee colonies died in the winter and spring of 2006–2007 in the USA while the same phenomenon took place also in various countries in Europe.[2]. The characteristics of this phenomenon is the sudden vanishing of adult honey bees from colonies in apiaries. In the same time no dead-bees bodies were found and young immature bees , honey and bee bread were left behind still in the beehive. Pesticides , between others , were proposed as a possible cause of this incident. [3]. Pesticide contamination in the beehive environment can occur in a direct and indirect way. Bee keepers directly use acaricides like amitraz, tau-fluvalinate, coumaphos and malathion in order to address the external acaricide Varroa.[4]. In addition each time a bee lands on a flower in order to collect pollen and nectar there is the possibility of them to be contaminated by pesticides sprayed on the corps nearby. Taking also in consideration the ability of the bees to fly in a range up to 7km around the hive it is very easy of the indirect contamination to occur. That is also a reason why bees and their products are characterized is bio-indicators for the pesticide contamination on the environment.[5]. Bee pollen especially is been considered as an important bio-indicator because of the way it is been collected. As mentioned above bees collect pollen when they land on a flower, later this pollen is been mixed with nectar, wax, enzymes, honey and honeydew and bee pollen is formed as small colored round balls. The color of bee pollen depends on the flower that they were collected from.[6]. Bee pollen is also a main source of food for the bees which means that pesticides that may be present in it can be transferred at the rest bee products. [1]. The nutritional and health value of bee pollen has also been acknowledged and is has been characterized as “the perfect food” for the human because of the presence of macronutrients like proteins , carbohydrates ,in the form of sugars and fiber, and fats and also micronutrients like flavonoids, carotenoids ,minerals and vitamins.[1], [6]. General health benefits like anti-oxidant and anti inflammatory properties found in bee pollen are been ascribed on the components above.[7]. Beside the environmental and market interest for bee pollen, maximum residue limits (MRLs) for pesticides have not been yest established by the EU [12] . The validation of a proper analytical method for the determination of pesticides residues in bee pollen is crucial. Through the literature the application of a Quechers exctraction method first proposed by (Anastassiades et al., 2003) individually modified is widely used in combination with GC-MS but mainly LC-MS chromatographic techniques.[10]. The are a lot of challenges present in the analysis of bee pollen [15] and it is characterized as very challenging beehive matrix because of it’s complex composition. The low water content of pollen (5 – 10%) results to significant and direct influence of its biomolecules to the analysis. Further complication occurs because bee-collected pollen usually is sourced from a variety of different plants that are combined together when they are been released on the market for sale. This possible combination of dissimilar and varying concentration of biomolecules and low water content can significantly interfere with the analysis of pesticides in pollen. [11] More precisely ,in liquid chromatography tandem-mass spectrometry (LC-MS/MS) analysis for example the bee pollen matrix influences the ionization efficiency of analytes in the source of the mass spectrometer using electrospray ionization or atmospheric pressure chemical ionization. In general ionization efficiency is a function of various components like the analytes, the matrix components , the ionization technique, the temperature, the voltage and the elution source.[11] In this study a Quechers method coupled to an LC LTQ/Orbitrap-MS instruments was optimized in order to propose a valid and trustworthy process for the determination and quantification of pesticide residues in bee pollen. During the process the EN 15662 variation of QuEChERS method, using citrate salts, was proposed as the best extraction option . The clean-up step was optimized using a combination of PSA, C18 and z-Sep+ clean up salts with the addition of a freezing step. The method quantification limits MQLs ranged between 5μg/Kg for compounds like atrazine and diazinon and 54.4μg/Kg for clothianidin and (z) – Mevinphos except chlorpyrifos with MQL = 99μg/Kg. The method was validated for 43 compounds in total and it was applied on 11 commercially available bee pollen samples. Meanwhile the results were evaluated through a risk assessment for human consumption and bees. The results showed only one positive detection for the fungicide pyraclostrobin in one sample. The risk assessment results show notable risk for the human consumption but no risk was determined for bees. The small amount of pollen samples (11) in addition to the one only positive detection were not adequate for the extraction of a safe conclusion considering the risk assessment.
Περιγραφή
Λέξεις-κλειδιά
Φυτοφάρμακα, Γύρη, Ανάλυση, UPLC, HRMS, Orvitrap, Quechers
Θεματική κατηγορία
Αναλυτική χημεία, Χημεία περιβάλλοντος, Χημεία τροφίμων
Παραπομπή
Σύνδεσμος
Γλώσσα
el
Εκδίδον τμήμα/τομέας
Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων. Σχολή Θετικών Επιστημών. Τμήμα Χημείας
Όνομα επιβλέποντος
Αλμπάνης, Τριαντάφυλλος
Εξεταστική επιτροπή
Αλμπάνης, Τριαντάφυλλος
Χελά, Δήμητρα
Κωνσταντίνου, Ιωάννης
Χελά, Δήμητρα
Κωνσταντίνου, Ιωάννης
Γενική Περιγραφή / Σχόλια
Ίδρυμα και Σχολή/Τμήμα του υποβάλλοντος
Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων. Σχολή Θετικών Επιστημών
Πίνακας περιεχομένων
Χορηγός
Βιβλιογραφική αναφορά
Ονόματα συντελεστών
Αριθμός σελίδων
129 σ.