Πρωτεωμικός χαρακτηρισμός καρδιομυοκυττάρων προερχόμενων από εμβρυονικά βλαστικά κύτταρα ανθρώπου
Loading...
Date
Authors
Γκουγκούσης, Χρήστος
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Publisher
Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων. Σχολή Επιστημών Υγείας. Τμήμα Ιατρικής
Abstract
Type
Type of the conference item
Journal type
Educational material type
Conference Name
Journal name
Book name
Book series
Book edition
Alternative title / Subtitle
o ρόλος της σηματοδότησης του ΝΟ
Description
Οι πρόσφατες εξελίξεις στον τομέα των εμβρυονικών βλαστικών κυττάρων (ESCs) προσφέρουν ευκαιρίες για καλύτερη κατανόηση της μοριακής βάσης των ανθρώπινων ασθενειών και για την ανάπτυξη μοντέλων ασθενειών για την δοκιμή νέων θεραπευτικών μεθόδων.
Τα καρδιομυοκύτταρα προσλαμβάνουν περίπου το 70% των μορίων ATP που απαιτούνται για τις φυσιολογικές συσταλτικές, ιοντικές αλλά και για άλλες σημαντικές λειτουργείες τους, από την μιτοχονδριακή β-οξείδωση (mFAO). H αναποτελεσματική β-οξείδωση συνεπάγεται, μειωμένη παραγωγή ATP, μεταβολική ανισορροπία και οδηγεί σε καρδιακή δυσλειτουργία και παθολογία. Η πλήρης κατανόηση των μηχανισμών ρύθμισης της β-οξείδωσης υπό παθοφυσιολογικές συνθήκες, δεν έχει επιτευχθεί ακόμα κυρίως εξαιτίας της
έλλειψης πειραματικών μοντέλων που αναπαράγουν πιστά την ανθρώπινη παθοφυσιολογία. Τα παλλόμενα καρδιομυοκύτταρα που προέρχονται από εβρυονικά βλαστικά κύτταρα αποτελούν ένα ελκυστικό πειραματικό μοντέλο. Στην παρούσα εργασία
πραγματοποιήσαμε πρωτεομικό χαρακτηρισμό των προερχόμενων από hESCs, καρδιομυοκυττάρων, εστιάζοντας στα επίπεδα έκφρασης καρδιοειδικών δεικτών καθώς και των πρωτεϊνών που συμμετέχουν στο μονοπάτι της β-οξείδωσης. Παρατηρήθηκε ότι η έκφραση των πρωτεϊνών Troponin-T και SIRP-α, είναι υψηλότερη σε διαφοροποιημένα καρδιομυοκύτταρα σε σχέση με τα εμβρυονικά βλαστικά κύτταρα. Η χρήση κυτταρομετρίας ροής αποκάλυψε ότι η Troponin-T εκφράζεται στο 70% των κυττάρων την 14η ημέρα της διαφοροποίησης. Σε ότι αφορά την β-οξείδωση, εξετάστηκε η έκφραση των, carnitine palmitoyl-transferase-2 (CPT2),
very long chain acyl-CoA dehydrogenase (VLCAD) and trifunctional protein A (TFPa), σε εμβρυονικά βλαστικά και σε διαφοροποιημένα καρδιομυοκύτταρα. Παρατηρήθηκε αύξηση των επιπέδων έκφρασης των παραπάνω πρωτεϊνών στα διαφοροποιημένα κύτταρα σε σχέση με τα αδιαφοροποίητα. Σε διαφοροποιημένα καρδιομυοκύτταρα εξετάστηκε η παρουσία S νιτροζυλιωμένων πρωτεϊνών. Η S-νιτροζυλίωση αποτελεί έναν από τους μηχανισμούς σηματοδότησης του NO. Παρατηρήθηκε ενδογενής S-νιτροζυλίωση σε διαφοροποιημένα καρδιομυοκύτταρα γεγονός που υποδηλώνει την ύπαρξη μιας πηγής παραγωγής ΝΟ. Μεταξύ των S-νιτροζυλιωμένων πρωτεϊνών ήταν και τα ένζυμα της β-οξείδωσης. Συνοπτικά, η διαφοροποίηση εμβρυονικών βλαστικών κυττάρων προς καρδιοκύτταρα είναι αποτελεσματική. Τα καρδιομυοκύτταρα εκφράζουν τα κύρια ένζυμα της β-οξείδωσης. Η παρούσα μελέτη παρέχει πρωταρχικά αποτελέσματα σχετικά με τη ρύθμιση της β-οξείδωσης από την σηματοδότηση του ΝΟ.
Recent advances in the field of embryonic stem (ESCs) cells have provided opportunities for better understanding the molecular basis of human diseases and the development of disease models to test novel therapeutics. Cardiomyocytes derive 70% of the ATP molecules that are required for normal contractile, ionic, and other important functions through the mitochondrial β- oxidation pathway (mFAO). Deficiencies of FAO pathway result in inadequate ATP production, metabolic imbalance, and cardiac dysfunction. Our understanding regarding the regulation of β-oxidation under pathophysiological conditions has lagged due to the lack of experimental models that recapitulate human physiology and disease. Contracting cardiomyocytes derived from differentiated ESCs represent an attractive experimental model. Herein, we performed proteomic characterization of ESCs-derived cardiomyocytes following the expression levels of Troponin-T and SIRPA as markers of cells maturation. Western blot analysis documented the presence of both proteins in lysates prepared from cells differentiated for 14 days. Proteins were not detected in undifferentiated cells. Immunostaining of fixed cells as well as flow cytometric analysis of live cells revealed that troponin-T was expressed in 70% of the cells differentiated for 14 days. Moreover, the expression of carnitine palmitoyl- transferase-2 (CPT2), very long chain acyl-CoA dehydrogenase (VLCAD) and trifunctional protein A (TFPa), the three obligate partners for mFAO, was documented in mature cardiomyocytes. To start gaining insights regarding the regulation of b- oxidation by nitric oxide signaling we examined the S-nitrosylation status of the three enzymes. We and others have shown that S-nitrosylation, an NO-derived posttranslational modification, regulates protein function and coordinates metabolic activity. Chemoselective enrichment followed by western blot analysis revealed the presence of CPT2, VLCAD and TFPa in the bound fractions indicating the endogenous S-nitrosylation of these proteins. In summary, ESCs-derived cardiomyocytes express key enzymes participating to mFAO. Our study provides initial evidence regarding the regulation of this pathway by NO-signaling. 10
Recent advances in the field of embryonic stem (ESCs) cells have provided opportunities for better understanding the molecular basis of human diseases and the development of disease models to test novel therapeutics. Cardiomyocytes derive 70% of the ATP molecules that are required for normal contractile, ionic, and other important functions through the mitochondrial β- oxidation pathway (mFAO). Deficiencies of FAO pathway result in inadequate ATP production, metabolic imbalance, and cardiac dysfunction. Our understanding regarding the regulation of β-oxidation under pathophysiological conditions has lagged due to the lack of experimental models that recapitulate human physiology and disease. Contracting cardiomyocytes derived from differentiated ESCs represent an attractive experimental model. Herein, we performed proteomic characterization of ESCs-derived cardiomyocytes following the expression levels of Troponin-T and SIRPA as markers of cells maturation. Western blot analysis documented the presence of both proteins in lysates prepared from cells differentiated for 14 days. Proteins were not detected in undifferentiated cells. Immunostaining of fixed cells as well as flow cytometric analysis of live cells revealed that troponin-T was expressed in 70% of the cells differentiated for 14 days. Moreover, the expression of carnitine palmitoyl- transferase-2 (CPT2), very long chain acyl-CoA dehydrogenase (VLCAD) and trifunctional protein A (TFPa), the three obligate partners for mFAO, was documented in mature cardiomyocytes. To start gaining insights regarding the regulation of b- oxidation by nitric oxide signaling we examined the S-nitrosylation status of the three enzymes. We and others have shown that S-nitrosylation, an NO-derived posttranslational modification, regulates protein function and coordinates metabolic activity. Chemoselective enrichment followed by western blot analysis revealed the presence of CPT2, VLCAD and TFPa in the bound fractions indicating the endogenous S-nitrosylation of these proteins. In summary, ESCs-derived cardiomyocytes express key enzymes participating to mFAO. Our study provides initial evidence regarding the regulation of this pathway by NO-signaling. 10
Description
Keywords
Διαφοροποίηση ESCs, Μονοξείδιο του Αζώτου, Λιπαρά οξέα, β-οξείδωση
Subject classification
Μοριακή Βιολογία
Citation
Link
Language
el
Publishing department/division
Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων. Σχολή Επιστημών Υγείας. Τμήμα Ιατρικής
Advisor name
Δούλιας, Πασχάλης- Θωμάς
Examining committee
Παπαμαρκάκη, Θωμαΐς
Χριστοφορίδης, Σάββας
Κούκλης, Παναγιώτης
Φριλίγγος, Ευστάθιος
Δούλιας, Πασχάλης-Θωμάς
Χριστοφορίδης, Σάββας
Κούκλης, Παναγιώτης
Φριλίγγος, Ευστάθιος
Δούλιας, Πασχάλης-Θωμάς
General Description / Additional Comments
Institution and School/Department of submitter
Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων. Σχολή Επιστημών Υγείας
Table of contents
Sponsor
Bibliographic citation
Name(s) of contributor(s)
Number of Pages
108 σ.
Course details
Endorsement
Review
Supplemented By
Referenced By
Creative Commons license
Except where otherwised noted, this item's license is described as CC0 1.0 Universal