Μελέτη πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων πρωτεϊνών που περιέχουν εγγενώς μη δομημένες περιοχές
Φόρτωση...
Ημερομηνία
Συγγραφείς
Τσιναφορνιώτης, Δημήτριος
Tsinaforniotis, Dimitrios
Τίτλος Εφημερίδας
Περιοδικό ISSN
Τίτλος τόμου
Εκδότης
Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων. Σχολή Επιστημών Υγείας. Τμήμα Ιατρικής. Εργαστήριο Βιολογικής Χημείας
Περίληψη
Τύπος
Είδος δημοσίευσης σε συνέδριο
Είδος περιοδικού
Είδος εκπαιδευτικού υλικού
Όνομα συνεδρίου
Όνομα περιοδικού
Όνομα βιβλίου
Σειρά βιβλίου
Έκδοση βιβλίου
Συμπληρωματικός/δευτερεύων τίτλος
Περιγραφή
Οι εγγενώς μη δομημένες ή εύκαμπτες πρωτεΐνες (IDPs), καθώς και οι εγγενώς μη δομημένες ή εύκαμπτες περιοχές (IDRs) πρωτεϊνών, βρίσκονται σε αφθονία στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς. Οι IDPs και IDR πρωτεΐνες είναι πολυλειτουργικές και σημαντικές για την εύρυθμη λειτουργία των κυττάρων. Επηρεάζουν όλα τα επίπεδα του κυττάρου, από το γονιδίωμα, μέχρι το πρωτέωμα. Έχουν συσχετιστεί με διάφορα σηματοδοτικά μονοπάτια, όπως με αυτό του μονοπατιού Hedgehog, που διαδραματίζει κρίσιμο ρόλο σε διάφορες πτυχές της εμβρυϊκής ανάπτυξης, της ομοιόστασης των ιστών και της κυτταρικής διαφοροποίησης των σπονδυλωτών. Επίσης, η απορρύθμιση των IDPs και IDR πρωτεϊνών σχετίζεται με διάφορα είδη καρκίνων. Η παρούσα εργασία έχει σκοπό την in vivo μελέτη των αλληλεπιδράσεων των πρωτεϊνών προθυμοσίνη α (ProTα) και παραθυμοσίνη (ParaT) με την συνδετική ιστόνη H1.2. Η ProTα και η ParaT αποτελούν πολυλειτουργικές πρωτεΐνες και λόγω της απουσίας σταθερής δευτεροταγούς, αλλά και τριτοταγούς δομής, κατατάσσονται στις εγγενώς μη δομημένες ή εύκαμπτες πρωτεΐνες (IDPs). Παράλληλα, μελετήθηκε η αλληλεπίδραση της ογκοπρωτεΐνης SET, η οποία περιέχει στη δομή της μια εγγενώς μη δομημένη/εύκαμπτη περιοχή (IDR), με την συνδετική ιστόνη H1.2 και την πυρηνική ιστόνη mH3.3. Ως μέθοδος ανάλυσης των προαναφερόμενων αλληλεπιδράσεων χρησιμοποιήθηκε η hGLuc Protein-Fragment Complementation Assay (hGLuc PCA) που βασίζεται στον ημι-ποσοτικό προσδιορισμό της βιοφωταύγειας της βελτιωμένης Gaussia λουσιφεράσης in vivo και in vitro. Η μέθοδος στηρίζεται στην έκφραση δύο συμπληρωματικών τμημάτων της βελτιωμένης Gaussia princeps λουσιφεράσης (πρωτεΐνη αναφοράς) με δύο πρωτεΐνες ενδιαφέροντος. Αν αυτές οι πρωτεΐνες αλληλεπιδράσουν, τα δύο συμπληρωματικά τμήματα της λουσιφεράσης αναδιπλώνονται μεταξύ τους, γίνεται ανασύσταση του ενεργού ενζύμου της Gaussia λουσιφεράσης και παράγεται βιοφωταύγεια. Ένας επιπλέον στόχος της εργασίας αυτής ήταν η μελέτη της επίδρασης της TTLL4 επαγόμενης πολυγλουταμυλίωσης των πρωτεϊνών ProTα, ParaT και SET, στην αλληλεπίδρασή τους με την H1.2. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα της παρούσας εργασίας επιβεβαιώθηκε η άμεση αλληλεπίδραση των πρωτεϊνών ProTα, ParaT και SET με την συνδετική ιστόνη H1.2, καθώς και της SET με την mH3.3, και έγινε ημι-ποσοτικοποίηση των αλληλεπιδράσεων αυτών τόσο in vivo, όσο και in vitro. Βρέθηκε ότι, η πολυγλουταμυλίωση, ως μετα-μεταφραστική τροποποίηση, έχει θετική επίδραση στις αλληλεπιδράσεις ProTα-Η1.2, ParaT-H1.2 και SET-H1.2. Επίσης, μελετήθηκε η κατανομή, καθώς και η κινητικότητα μέσω της τεχνικής FRAP, της συνδετικής ιστόνης H1.2, παρουσία των πρωτεϊνών ProTα, ParaT, SET και TTLL4, στην κυτταρική σειρά HEK293 mcherry-H1.2. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η H1.2 δεν εμφανίζει κάποια διαφορά ως προς την κατανομή της στον πυρήνα των κυττάρων, όταν συνεκφράζεται με τις παραπάνω πρωτεΐνες, στα κύτταρα HEK293 mcherry-H1.2. Όσον αφορά την κινητικότητα της Η1.2, μέσω της τεχνικής FRAP παρατηρήθηκαν σημαντικές αλλαγές μετά την υπερέκφραση των πρωτεϊνών ProTα, ParaT και SET, λόγω της αλληλεπίδρασης της ιστόνης με αυτές τις πρωτεΐνες, όπως ήταν αναμενόμενο. Στα ίδια κύτταρα, μέσω της τεχνικής FRAP, αποδείχθηκε ότι η υπερέκφραση της πολυγλουταμυλάσης TTLL4 επηρεάζει την κινητικότητα της συνδετικής ιστόνης H1.2 στον πυρήνα τους, τόσο απουσία, όσο και παρουσία των πρωτεϊνών ProTα, ParaT και SET.
Intrinsically disordered proteins (IDPs), as well as intrinsically disordered regions (IDRs) of proteins, are abundant in eukaryotic organisms. IDPs or IDR proteins are multifunctional and important for the proper functioning of cells. They affect all levels of the cell, from the genome to the proteome. They have been associated with various signaling pathways, such as the Hedgehog pathway, which plays a critical role in various aspects of embryonic development, tissue homeostasis and cell differentiation in vertebrates. Also, dysregulation of IDPs or IDR proteins is associated with various types of cancer. The purpose of this work is the in vivo study of the interactions of prothymosin α (ProTα) and parathymosin (ParaT) proteins with the linker histone H1.2. ProTα and ParaT are multifunctional proteins and due to the absence of stable secondary and tertiary structure, they are classified as intrinsically disordered proteins (IDPs). In parallel, the interaction of the oncoprotein SET, which contains in its structure an intrinsically disordered domain (IDR), with the linker histone H1.2 and the core histone mH3.3 was studied. The hGLuc Protein-Fragment Complementation Assay (hGLuc PCA), which is based on the semi-quantitative determination of the bioluminescence of humanized Gaussia luciferase in vivo and in vitro, used as a method to analyze the aforementioned interactions. The method is based on the expression of two complementary parts of the humanized Gaussia princeps luciferase (reporter protein) with two proteins of interest. If these proteins interact, the two complementary luciferase segments fold together, the active Gaussia luciferase enzyme is reconstituted, and bioluminescence is produced. An additional aim of this work was to study the effect of TTLL4-mediated polyglutamylation of ProTα, ParaT and SET proteins, on their interaction with H1.2. According to the results of this work, the direct interaction of ProTα, ParaT and SET proteins with the linker histone H1.2, as well as the direct interaction of SET with mH3.3 was confirmed, and semi-quantification of these interactions was done both in vivo and in vitro. Polyglutamylation, as a post-translational modification, was found to have a positive effect on ProTα-H1.2, ParaT-H1.2 and SET-H1.2 interactions. In addition, the distribution, as well as the mobility through the FRAP technique, of the linker histone H1.2, in the presence of ProTα, ParaT, SET and TTLL4 proteins, in the HEK293 mcherry-H1.2 cell line was studied. Our findings suggest that H1.2 does not show any difference in its nuclear distribution when co-expressed with the above proteins in HEK293 mcherry-H1.2 cells. Regarding to the mobility of H1.2, significant changes were observed by the FRAP technique after overexpression of ProTα, ParaT and SET proteins, due to histone interaction with these proteins, as expected. In the same cell line, through the FRAP technique, it was proven that the overexpression of TTLL4 polyglutamylase affects the mobility of the linker histone H1.2 in the cell nucleus, both in absence and in presence of ProTα, ParaT and SET proteins.
Intrinsically disordered proteins (IDPs), as well as intrinsically disordered regions (IDRs) of proteins, are abundant in eukaryotic organisms. IDPs or IDR proteins are multifunctional and important for the proper functioning of cells. They affect all levels of the cell, from the genome to the proteome. They have been associated with various signaling pathways, such as the Hedgehog pathway, which plays a critical role in various aspects of embryonic development, tissue homeostasis and cell differentiation in vertebrates. Also, dysregulation of IDPs or IDR proteins is associated with various types of cancer. The purpose of this work is the in vivo study of the interactions of prothymosin α (ProTα) and parathymosin (ParaT) proteins with the linker histone H1.2. ProTα and ParaT are multifunctional proteins and due to the absence of stable secondary and tertiary structure, they are classified as intrinsically disordered proteins (IDPs). In parallel, the interaction of the oncoprotein SET, which contains in its structure an intrinsically disordered domain (IDR), with the linker histone H1.2 and the core histone mH3.3 was studied. The hGLuc Protein-Fragment Complementation Assay (hGLuc PCA), which is based on the semi-quantitative determination of the bioluminescence of humanized Gaussia luciferase in vivo and in vitro, used as a method to analyze the aforementioned interactions. The method is based on the expression of two complementary parts of the humanized Gaussia princeps luciferase (reporter protein) with two proteins of interest. If these proteins interact, the two complementary luciferase segments fold together, the active Gaussia luciferase enzyme is reconstituted, and bioluminescence is produced. An additional aim of this work was to study the effect of TTLL4-mediated polyglutamylation of ProTα, ParaT and SET proteins, on their interaction with H1.2. According to the results of this work, the direct interaction of ProTα, ParaT and SET proteins with the linker histone H1.2, as well as the direct interaction of SET with mH3.3 was confirmed, and semi-quantification of these interactions was done both in vivo and in vitro. Polyglutamylation, as a post-translational modification, was found to have a positive effect on ProTα-H1.2, ParaT-H1.2 and SET-H1.2 interactions. In addition, the distribution, as well as the mobility through the FRAP technique, of the linker histone H1.2, in the presence of ProTα, ParaT, SET and TTLL4 proteins, in the HEK293 mcherry-H1.2 cell line was studied. Our findings suggest that H1.2 does not show any difference in its nuclear distribution when co-expressed with the above proteins in HEK293 mcherry-H1.2 cells. Regarding to the mobility of H1.2, significant changes were observed by the FRAP technique after overexpression of ProTα, ParaT and SET proteins, due to histone interaction with these proteins, as expected. In the same cell line, through the FRAP technique, it was proven that the overexpression of TTLL4 polyglutamylase affects the mobility of the linker histone H1.2 in the cell nucleus, both in absence and in presence of ProTα, ParaT and SET proteins.
Περιγραφή
Λέξεις-κλειδιά
Εγγενώς μη δομημένες περιοχές, Εγγενώς μη δομημένες πρωτεΐνες, Λουσιφεράση, PCAs, hGLuc PCA, FRAP
Θεματική κατηγορία
Μελέτη πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων, Study of protein interactions
Παραπομπή
Σύνδεσμος
Γλώσσα
el
Εκδίδον τμήμα/τομέας
Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων. Σχολή Επιστημών Υγείας. Τμήμα Ιατρικής. Εργαστήριο Βιολογικής Χημείας
Όνομα επιβλέποντος
Παπαμαρκάκη, Θωμαΐς
Εξεταστική επιτροπή
Λιακόπουλος, Δημήτριος
Μπέης, Δημήτριος
Παπαμαρκάκη, Θωμαΐς
Πολίτου, Αναστασία
Φριλίγγος, Ευστάθιος
Μπέης, Δημήτριος
Παπαμαρκάκη, Θωμαΐς
Πολίτου, Αναστασία
Φριλίγγος, Ευστάθιος
Γενική Περιγραφή / Σχόλια
Ίδρυμα και Σχολή/Τμήμα του υποβάλλοντος
Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων. Σχολή Επιστημών Υγείας. Τμήμα Ιατρικής
Πίνακας περιεχομένων
Χορηγός
Βιβλιογραφική αναφορά
Ονόματα συντελεστών
Αριθμός σελίδων
115
Λεπτομέρειες μαθήματος
item.page.endorsement
item.page.review
item.page.supplemented
item.page.referenced
Άδεια Creative Commons
Άδεια χρήσης της εγγραφής: Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 United States