Μεθυλοτρανσφεράσες ως εργαλεία για τη στοχευμένη τροποποίηση φυσικών βιοδραστικών προϊόντων
Loading...
Date
Authors
Δημητρακούλη, Αθανασία
Dimitrakouli, Athanasia
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Publisher
Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων. Σχολή Θετικών Επιστημών. Τμήμα Χημείας
Abstract
Type
Type of the conference item
Journal type
Educational material type
Conference Name
Journal name
Book name
Book series
Book edition
Alternative title / Subtitle
Description
Η μεθυλίωση ενώσεων είναι μια στρατηγική που ακολουθούν οι φαρμακοβιομηχανίες προκειμένου να αναπτύξουν νέες ενώσεις, οι οποίες λόγω της μεθυλίωσης φέρουν βελτιωμένες ιδιότητες ακόμη και νέες βιολογικές δράσεις. Τα φυσικά προϊόντα είναι ενώσεις με σημαντικές βιολογικές δράσεις για αυτό και χρησιμοποιούνται ευρέως. Εμφανίζουν φυσικά μεθυλιωμένα ανάλογα διαθέτοντας σημαντική βιοδραστικότητα, η οποία κάποιες φορές είναι καλύτερη από αυτή που παρουσιάζει η εκάστοτε πρόδρομη ένωση. Σκοπός της παρούσας εργασίας, λοιπόν, είναι η στοχευμένη τροποποίηση φυσικών προϊόντων με χρήση ενζύμων μεθυλοτρανσφερασών για την παραγωγή μεθυλιωμένων παραγώγων με ποικίλες βιολογικές δράσεις.
Ως βιοκαταλύτες χρησιμοποιήθηκαν οι μεθυλοτρανσφεράσες άγριου τύπου (WT) από τους οργανισμούς Catharanthus roseus (CaROMT) και Clarkia breweri (IeOMT), ενώ από τον τελευταίο οργανισμό χρησιμοποιήθηκαν και δύο μεταλλάξεις η T133M και η T133M /Y326L. Το κάθε ένζυμο ξεχωριστά διαθέτει διαφορετική δραστικότητα και τοποεκλεκτικότητα. Αρχικά μέσω HPLC, ελέγχθηκε η δραστικότητα των ελεύθερων ενζύμων σε αντιδράσεις μεθυλίωσης με τα φυσικά υποστρώματα της ισοευγενόλης για τα ένζυμα IeOMT και του καφεϊκού οξέος για το ένζυμο CaRO WT. Έπειτα, πραγματοποιήθηκε η ακινητοποίησή τους σε μαγνητικά νανοσωματίδια οξειδίου του σιδήρου επικαλυμμένα με πολυντοπαμίνη και νικέλιο (F3O4@polydopamine-Ni(II)), μια τεχνική ακινητοποίησης που βασίζεται στις αρχές της χρωματογραφίας IMAC για ένζυμα που διατεθούν αλληλουχία His-tag και παρέχει ταυτόχρονα καθαρισμό και ακινητοποίηση των ενζύμων. Οι συνθήκες της ακινητοποίησης μελετήθηκαν σχετικά με το χρόνο επώασης (30 λεπτά, 2 και 4 ώρες) και την αναλογία νανοϋλικού : κυτταρικού εκχυλίσματος (1:2 και 1:4). Τα αποτελέσματα έδειξαν πως οι βέλτιστες τιμές αυτών των παραγόντων της ακινητοποίησης είναι ο χρόνος των 30 λεπτών και η αναλογία 1:4.
Για πρώτη φορά, η τροποποίηση υποστρωμάτων της τυροσόλης και υδροξυτυροσόλης έλαβε χώρα από τα ακινητοποιημένα ένζυμα CaRO WT και ΙeΟΜΤ Τ133Μ, όπως και αυτής των υποστρωμάτων μορίνης, μυρικετίνης, φυσετίνης και ρεσβερατρόλης από τα ακινητοποιημένα ένζυμα ΙeΟΜΤ WT και IeOMT Τ133Μ/Y326L. Ο συνδυασμός των αναλύσεων HPLC, MS και NMR ανέδειξε ως προϊόν της μεθυλίωσης της τυροσόλης από το ΙeΟΜΤ Τ133Μ το para-μεθυλιωμένο ανάλογο, ενώ η τροποποίηση της από το CaRO WT δεν ήταν επιτυχής. Το ένζυμο ΙeΟΜΤ WT μεθυλίωσε την υδροξυτυροσόλη στη θέση meta, ενώ το ΙeΟΜΤ Τ133Μ έδωσε μίγμα προϊόντων με το para-μονομεθυλιωμένο να κυριαρχεί και η διμεθυλιωμένη υδροξυτυροσόλη σε θέση meta και para να ακολουθεί. Τα υπόλοιπα υποστρώματα (μορίνη, μυρικετίνη, φισετίνη και ρεσβερατρόλη) μελετήθηκαν περαιτέρω με το ένζυμο IeOMT Τ133Μ/Y326L λόγω μεγαλύτερης δραστικότητας που εμφάνισε συγκριτικά με του άγριου τύπου. Η τοποεκλεκτικότητα της αντίδρασης της μυρικετίνης φαίνεται να είναι στις θέσεις 3΄και 5΄ με την παραγωγή της διμέθυλο μυρικετίνης, αυτής της φισετίνης στη θέση 3΄ με την ύπαρξη της μονομέθυλο φισετίνης, ενώ η τοποεκλεκτικότητα της τροποποίησης της μορίνης δεν μπόρεσε να αποσαφηνιστεί. Το υπόστρωμα της ρεσβερατρόλης μεθυλιώθηκε δίνοντας μονομεθυλιωμένο και διμεθυιωμένο προϊόντα.
Τέλος, αναπτύχθηκε ένα φωτομετρικό πρωτόκολλο ανίχνευσης της δραστικότητας των μεθυλοτρανσφερασών με χρήση του ενζύμου SAHase του οργανισμού Bradyrhizobium elkanii, το οποίο υδρολύει το παραπροϊόν της μεθυλίωσης SAH και μέσω του αντιδραστηρίου Ellman παράγεται ένα έγχρωμο προϊόν που απορροφά. Το ένζυμο ακινητοποιήθηκε όπως και οι μεθυλοτρανσφεράσες. Περιοριστικός παράγοντας ήταν η χρήση της θειόλης DTT στις αντιδράσεις μεθυλίωσης καθώς αντιδρά με τον παράγοντα Ellman. Τα αποτελέσματα των αντιδράσεων μεθυλίωσης χωρίς DTT έδειξαν πως μπορεί να αποφευχθεί η χρήση του καθώς η απόδοση της αντίδρασης ανέρχεται άνω του 90 %. Επίσης, μελετήθηκαν οι παράγοντες του pH της αντίδρασης των δύο ενζύμων (pH 7.5 και pH 8.0), της θερμοκρασίας (28 και 35 ℃) και της αναλογίας ακινητοποιημένης μεθυτρανσφεράσης και ακινητοποιημένης SAHase (250 μL:50 μL και 250 μL : 25 μL). Βέλτιστες συνθήκες αντίδρασης φαίνεται να αντιστοιχούν στις τιμές pH 8.0, 28℃ και στην αναλογία 250 μL : 25 μL.
Methylation of compounds is a strategy followed by pharmaceutical industry to develop new compounds, which have improved properties and even new biological activities due to methylation. Natural products are compounds with significant biological activities therefore they are widely used. In nature, they occur as methylated analogues possessing important bioactivity, which is sometimes better than that presented by the respective precursor compound. Thus, the aim of this study is the targeted modification of natural products using methyltransferases enzymes for the production of either existing methylated analogues or new ones with various biological activities. Wild type (WT) of methyltransferases from the organisms Catharanthus roseus (CaROMT) and Clarkia breweri (IeOMT) were used as biocatalysts, while two mutations from the latter organism, T133M and T133M /Y326L, were also used. Each enzyme has different activity and regioselectivity. First, the activity of free enzymes was tested trough methylation reactions with the natural substrates isoeugenol for the IeOMT enzymes and caffeic acid for the CaRO WT enzyme using HPLC analysis. Then, they were immobilized on polydopamine-nickel-coated magnetic iron oxide nanoparticles (F3O4@polydopamine-Ni(II)), an immobilization technique based on principles of IMAC chromatography for His-tagged enzymes and providing simultaneous purification and enzyme immobilization. The immobilization conditions were studied with respect to incubation time (30 min, 2 and 4 h) and nanomaterial : cell extract ratio (1:2 and 1:4). The results showed that the optimal values of these immobilization factors are the time of 30 minutes and the ratio of 1:4. For the first time, modification of tyrosol and hydroxytyrosol occurred by immobilized CaRO WT and IeOMT T133M enzymes, as well as modification of morin, myricetin, fisetin and resveratrol occurred by immobilized IeOMT WT and IeOMT T133M/Y326L. The combination of HPLC, MS and NMR analyses revealed the para-methylated analogue as the product of the methylation of tyrosol by IeOMT T133M, while its modification by CaRO WT was not successful. The IeOMT WT enzyme methylated hydroxytyrosol in meta-OH, whereas IeOMT T133M gave a mixture of products with para-methylated product predominating, followed by meta- and para-dimethylated hydroxytyrosol. The methylation of the remaining substrates (morin, myricetin, fisetin and resveratrol) was further studied with the IeOMT T133M/Y326L enzyme due to its higher activity compared to the wild type of enzyme. The regioselectivity of the enzyme towards myricetin appears to be in the 3' and 5' positions with the production of dimethyl myricetin, in case of fisetin in the 3' position with the existence of monomethyl fisetin, while the regioselectivity regarding morin could not be clarified. Resveratrol was methylated to give monomethylated and dimethylated products. Finally, a photometric protocol was developed to detect the activity of methyltransferases using the SAHase enzyme from the organism Bradyrhizobium elkanii, which hydrolyzes the by-product of methylation, SAH, and through the Ellman’s reagent, a colored product is produced that absorbs at 412nm. The enzyme was immobilized as were the methyltransferases. A limiting factor was the use of the thiol DTT in the methylation reactions, as it reacts with Ellman's reagent. The results of the methylation reactions without DTT showed that its use can be avoided as the yield of the reaction was above 90 %. Additionally, the reaction’s factors of the two enzymes such as pH (pH 7.5 and pH 8.0), temperature (28 and 35 ℃) and the ratio of immobilized methytransferase and immobilized SAHase (250 μL:50 μL and 250 μL: 25 μL) were studied. The optimal reaction conditions seem to correspond to pH values of 8.0, temperature of 28℃ and a ratio of 250 µL: 25 µL.
Methylation of compounds is a strategy followed by pharmaceutical industry to develop new compounds, which have improved properties and even new biological activities due to methylation. Natural products are compounds with significant biological activities therefore they are widely used. In nature, they occur as methylated analogues possessing important bioactivity, which is sometimes better than that presented by the respective precursor compound. Thus, the aim of this study is the targeted modification of natural products using methyltransferases enzymes for the production of either existing methylated analogues or new ones with various biological activities. Wild type (WT) of methyltransferases from the organisms Catharanthus roseus (CaROMT) and Clarkia breweri (IeOMT) were used as biocatalysts, while two mutations from the latter organism, T133M and T133M /Y326L, were also used. Each enzyme has different activity and regioselectivity. First, the activity of free enzymes was tested trough methylation reactions with the natural substrates isoeugenol for the IeOMT enzymes and caffeic acid for the CaRO WT enzyme using HPLC analysis. Then, they were immobilized on polydopamine-nickel-coated magnetic iron oxide nanoparticles (F3O4@polydopamine-Ni(II)), an immobilization technique based on principles of IMAC chromatography for His-tagged enzymes and providing simultaneous purification and enzyme immobilization. The immobilization conditions were studied with respect to incubation time (30 min, 2 and 4 h) and nanomaterial : cell extract ratio (1:2 and 1:4). The results showed that the optimal values of these immobilization factors are the time of 30 minutes and the ratio of 1:4. For the first time, modification of tyrosol and hydroxytyrosol occurred by immobilized CaRO WT and IeOMT T133M enzymes, as well as modification of morin, myricetin, fisetin and resveratrol occurred by immobilized IeOMT WT and IeOMT T133M/Y326L. The combination of HPLC, MS and NMR analyses revealed the para-methylated analogue as the product of the methylation of tyrosol by IeOMT T133M, while its modification by CaRO WT was not successful. The IeOMT WT enzyme methylated hydroxytyrosol in meta-OH, whereas IeOMT T133M gave a mixture of products with para-methylated product predominating, followed by meta- and para-dimethylated hydroxytyrosol. The methylation of the remaining substrates (morin, myricetin, fisetin and resveratrol) was further studied with the IeOMT T133M/Y326L enzyme due to its higher activity compared to the wild type of enzyme. The regioselectivity of the enzyme towards myricetin appears to be in the 3' and 5' positions with the production of dimethyl myricetin, in case of fisetin in the 3' position with the existence of monomethyl fisetin, while the regioselectivity regarding morin could not be clarified. Resveratrol was methylated to give monomethylated and dimethylated products. Finally, a photometric protocol was developed to detect the activity of methyltransferases using the SAHase enzyme from the organism Bradyrhizobium elkanii, which hydrolyzes the by-product of methylation, SAH, and through the Ellman’s reagent, a colored product is produced that absorbs at 412nm. The enzyme was immobilized as were the methyltransferases. A limiting factor was the use of the thiol DTT in the methylation reactions, as it reacts with Ellman's reagent. The results of the methylation reactions without DTT showed that its use can be avoided as the yield of the reaction was above 90 %. Additionally, the reaction’s factors of the two enzymes such as pH (pH 7.5 and pH 8.0), temperature (28 and 35 ℃) and the ratio of immobilized methytransferase and immobilized SAHase (250 μL:50 μL and 250 μL: 25 μL) were studied. The optimal reaction conditions seem to correspond to pH values of 8.0, temperature of 28℃ and a ratio of 250 µL: 25 µL.
Description
Keywords
Βιοτεχνολογία, Ένζυμα, Βιοκατάλυση, Μεθυλοτρανσφεράσες, Ακινητοποίηση ενζύμων, Biotechnology, Enzymes, Biocatalysis, Methyltransferases, Enzyme immobilization
Subject classification
Βιοτεχνολογία, Biotechnology
Citation
Link
Language
el
Publishing department/division
Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων. Σχολή Θετικών Επιστημών. Τμήμα Χημείας
Advisor name
Σταμάτης, Χαράλαμπος
Examining committee
Σταμάτης, Χαράλαμπος
Καταπόδης, Πέτρος
Παυλίδης, Ιωάννης Β.
Καταπόδης, Πέτρος
Παυλίδης, Ιωάννης Β.
General Description / Additional Comments
Institution and School/Department of submitter
Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων. Σχολή Θετικών Επιστημών
Table of contents
Sponsor
Bibliographic citation
Name(s) of contributor(s)
Number of Pages
125 σ.
Course details
Endorsement
Review
Supplemented By
Referenced By
Creative Commons license
Except where otherwised noted, this item's license is described as Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 United States