MiR-9, an IKKα-regulated miRNA in lung cancer
Φόρτωση...
Ημερομηνία
Συγγραφείς
Μπέστα, Σιμώνη
Besta, Simoni
Τίτλος Εφημερίδας
Περιοδικό ISSN
Τίτλος τόμου
Εκδότης
Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων. Σχολή Επιστημών Υγείας. Τμήμα Ιατρικής
Περίληψη
Τύπος
Είδος δημοσίευσης σε συνέδριο
Είδος περιοδικού
Είδος εκπαιδευτικού υλικού
Όνομα συνεδρίου
Όνομα περιοδικού
Όνομα βιβλίου
Σειρά βιβλίου
Έκδοση βιβλίου
Συμπληρωματικός/δευτερεύων τίτλος
Περιγραφή
Lung cancer is the leading cause of cancer-related death worldwide and the second most common cancer in both men and women. Despite the development of new therapeutic approaches, the 5-year survival rates are still low and resistance to therapy often arises.
The NF-κB transcription factors (TFs) which can either activate or suppress gene expression, are also aberrantly activated in pulmonary diseases and non-small cell lung cancer (NSCLC), where they promote chronic inflammation, cell proliferation and survival. NF-κΒ transcription factors regulate the expression of protein coding and non-coding genes, such as microRNAs, however the intricate complexity of the NF-κΒ and miRNA regulatory network is yet to be fully understood.
The NF-κB TFs can be activated mainly by two signalling pathways: A canonical IKKβ-mediated NF-κΒ signalling pathway leading to the activation and nuclear translocation of the RelA/p50 heterodimeric TF where it binds to gene target promoters influencing gene expression, and a non-canonical IKKα-mediated NF-κΒ signalling pathway leading to the activation and nuclear translocation of the RelΒ/p52 heterodimeric TF where it binds to a distinct set of gene target promoters influencing gene expression. In addition, the upstream IKKβ and IKKα Ser/Thr activating kinases have also NF-κB independent effects.
The IKKα Ser/Thr kinase has been shown to act as a tumour suppressor in NSCLC, in an NF-κΒ independent manner. Our laboratory has previously demonstrated that IKKα silencing causes upregulation of the hypoxia inducible factor HIF-1α, promoting tumour growth under hypoxic conditions in two in vivo mouse and human lung cancer models. To further explore the mechanisms by which IKKα acts as a tumour suppressor in NSCLC, this thesis aimed to explore the miRNA expression profile of IKKα depleted cells and study their mechanism of action.
To identify miRNAs that are regulated by IKKα, the lung adenocarcinoma cell line A549 was chosen, and an IKKα knockdown (KD) stable cell line was generated. Total RNA from control and IKKαKD cells was isolated and Nanostring miRNA analysis was employed to study the expression levels of 800 miRNAs in the samples. MiR-9-5p was identified as the most significant hit, where loss of IKKα resulted in the upregulation of miR-9-5p expression. MiR-9-5p is a known tumour promoter miRNA and has been implicated in lung cancer progression and metastasis, although there is still lack of knowledge regarding its exact mechanism of action. Therefore, we chose to further study the role of miR-9-5p in NSCLC and miR-9-5p overexpressing stable cell lines were generated in A549 and H1299 cell lines.
Phenotypic assays were performed to study the effects of miR-9-5p on cell behaviour. While cell proliferation and cell cycle progression in vitro were not affected by the overexpression of miR-9-5p, cell invasiveness was significantly increased, implicating miR-9-5p in epithelial to mesenchymal cell transition (EMT). In contrast, in vivo growth of A549 and H1299 miR-9-5p as xenografts in immunocompromised NSG mice resulted in the formation of larger tumours, with A549 miR-9-5p tumours grown as xenografts weighing 2 times more and H1299 tumours weighing 2.2 times more than their control counterparts. In order to identify miR-9-5p potential targets, the mirDIP database was used to access predicted miR-9-5p targets, and the resulting set of genes was further reduced to Wnt-associated genes due to their well-described role in EMT. We found that miR-9-5p targets CDH1, the gene encoding for the critical adherens junction transmembrane protein, E-Cadherin. We showed that miR-9-5p-mediated loss of E-Cadherin promoted the upregulation of active β-catenin, the main downstream regulator of the Wnt pathway. In addition, the main inhibitor of β-catenin, GSK-3β, was found inactivated, while the positive regulator of β-catenin, Akt-1, was found activated in miR-9-5p overexpressing cells. The EMT markers N-Cadherin and Vimentin were also upregulated in miR-9-5p overexpressing cells, further confirming the induction of an EMT-like phenotype. In conclusion, IKKα acts as tumour suppressor by suppressing the expression of the oncogenic miR-9-5p. We have demonstrated that miR-9-5p acts as a tumour promoter in NSCLC by targeting E-Cadherin, activating the Akt-1/GSK-3β/β-catenin pathway and promoting the expression of EMT related factors N-Cadherin and Vimentin, leading to increased cell invasion and tumour growth.
Ο καρκίνος του πνεύμονα αποτελεί το δεύτερο συχνότερο τύπο καρκίνου και την κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο παγκοσμίως. Παρά την ανάπτυξη νέων θεραπευτικών προσεγγίσεων, το ποσοστό πενταετούς επιβίωσης των ασθενών παραμένει χαμηλό λόγω της διάγνωσης σε προχωρημένα στάδια της νόσου αλλά και της εμφάνισης ανθεκτικότητας στη θεραπεία. Οι μεταγραφικοί παράγοντες (TFs) NF-κB δρουν επάγοντας ή καταστέλλοντας την έκφραση μιας μεγάλης ποικιλίας γονιδίων στόχων. Σε χρόνιες φλεγμονώδεις νόσους του πνεύμονα, καθώς και στον καρκίνο του πνεύμονα, η σηματοδοτική πορεία του NF-κΒ συχνά απορρυθμίζεται με αποτέλεσμα την ιδιοστατική ενεργοποίησή της. Η απορρύθμιση αυτή οδηγεί σε χρόνια φλεγμονή, προαγωγή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και της κυτταρικής επιβίωσης. Οι μεταγραφικοί παράγοντες NF-κB ρυθμίζουν την έκφραση γονιδίων που κωδικοποιούν πρωτεΐνες αλλά και μη κωδικά μόρια RNA, όπως τα microRNA (ή μικρά μόρια RNA), ωστόσο η σχέση μεταξύ NF-κB και miRNA δεν έχει ακόμη πλήρως αποσαφηνιστεί. Η ενεργοποίηση των μεταγραφικών παραγόντων NF-κB επιτυγχάνεται με δύο κύριες πορείες σηματοδότησης: την IKKβ-εξαρτώμενη κανονική σηματοδοτική πορεία, κατά την οποία τα ετεροδιμερή RelA/p65-p50 και cRel-p50 μετατοπίζονται στον πυρήνα όπου ρυθμίζουν την έκφραση γονιδίων-στόχων τους, και την IKKα-εξαρτώμενη μη κανονική πορεία του NF-κB κατά την οποία η πυρηνική μετατόπιση των ετεροδιμερών RelB/p52 προάγει την ενεργοποίηση ενός διαφορετικού συνόλου γονιδίων στόχων. Οι κινάσες σερίνης/θρεονίνης IKKβ και IKKα είναι οι κύριοι ανοδικοί ενεργοποιητές της κανονικής και μη κανονικής πορείας του NF-κΒ, αντίστοιχα, ωστόσο συχνά εμφανίζουν και δράσεις ανεξάρτητες από την ενεργοποίηση των μεταγραφικών παραγόντων NF-κΒ. Η IKKα εμφανίζει ογκοκατασταλτική δράση στον NSCLC, ανεξάρτητα από τη μη κανονική πορεία του NF-κB. Το εργαστήριο μας ανέπτυξε δυο μοντέλα NSCLC ποντικού και ανθρώπου in vivo, όπου η αποσιώπηση της IKKα οδήγησε στην ενεργοποίηση του μεταγραφικού παράγοντα HIF-1α, προάγοντας την ανάπτυξη όγκων σε συνθήκες υποξίας in vivo. Για την περαιτέρω διερεύνηση των μηχανισμών της ογκοκατασταλτικής δράσης της IKKα στον NSCLC, σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η μελέτη του προφίλ έκφρασης των miRNA σε κυτταρικές σειρές NSCLC μετά από την αποσιώπηση της IKKα και η μελέτη του πιθανού μηχανισμού δράσης τους. Για τη μελέτη των miRNA που ρυθμίζονται από την κινάση IKKα, χρησιμοποιήθηκε η κυτταρική σειρά NSCLC, A549, και αρχικά κατασκευάστηκε μια σταθερή κυτταρική σειρά με μειωμένα επίπεδα έκφρασης της IKKα (IKKα knockdown, IKKαKD). Στη συνέχεια απομονώθηκε ολικό RNA από κύτταρα ελέγχου και κύτταρα IKKαKD και αναλύθηκε η έκφραση των miRNA μέσω της τεχνολογίας Nanostring. Από τα διαφορικά εκφραζόμενα miRNA, το miR-9-5p παρουσίασε τη μεγαλύτερη αύξηση, κατά 2.13 φορές, στα κύτταρα ΙΚΚαKD σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου. Το miR-9-5p εμφανίζει ογκογόνο δράση σε διάφορους τύπους καρκίνου και η αυξημένη έκφρασή του έχει συσχετιστεί με προχωρημένα στάδια της νόσου καθώς και την ύπαρξη μεταστάσεων στον καρκίνο του πνεύμονα, ωστόσο ο μηχανισμός δράσης του δεν έχει μελετηθεί πλήρως. Επομένως, επιλέξαμε να μελετήσουμε τον ρόλο του miR-9-5p στο NSCLC και για το σκοπό αυτό κατασκευάστηκαν σταθερές κυτταρικές σειρές Α549 και Η1299 οι οποίες υπερ-εκφράζουν το miR-9-5p. Για τη διερεύνηση του ρόλου του miR-9-5p στην ανάπτυξη του NSCLC μελετήθηκε αρχικά η επίδραση του miR-9-5p στον πολλαπλασιασμό και την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου των καρκινικών κυττάρων in vitro. Η υπερ-έκφραση του miR-9-5p δεν είχε καμία στατιστικά σημαντική επίδραση στον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων, όπως καταδείχθηκε από τις καμπύλες ανάπτυξης και την ανάλυση του κυτταρικού κύκλου με κυτταρομετρία ροής. Αντίθετα, η υπερ-έκφραση του miR-9-5p οδήγησε σε σημαντική αύξηση της κυτταρικής διήθησης (cell invasion), υποδεικνύοντας ένα πιθανά σημαντικό ρόλο του miR-9-5p στη διαδικασία της επιθηλιακής προς μεσεγχυματικής κυτταρικής μετατροπής (epithelial to mesenchymal cell transition, EMT). Για την εύρεση πιθανών στόχων του miR-9-5p, αξιοποιήθηκε η βάση δεδομένων mirDIP, και από το σύνολο των πιθανών γονιδίων στόχων που ταυτοποιήθηκαν επιλέχθηκαν τα γονίδια που σχετίζονται με τη σηματοδοτική πορεία Wnt, μια από τις κύριες πορείες που ρυθμίζουν τη διαδικασία της EMT. Ολικά πρωτεϊνικά εκχυλίσματα αναλύθηκαν με ανοσοαποτύπωμα κατά Western για την έκφραση της Ε-καντερίνης, η οποία διαδραματίζει βασικό ρόλο στον σχηματισμό των συνδέσμων πρόσφυσης (adherens junctions) μεταξύ γειτονικών επιθηλιακών κυττάρων. Τα αποτελέσματα κατέδειξαν την κατακόρυφη μείωση των επιπέδων έκφρασης της Ε-καντερίνης μετά από την υπερ-έκφραση του miR-9-5p γεγονός που καταδεικνύει το γονίδιο CDH1 ως στόχο του miR-9-5p. H απώλεια της E-καντερίνης έχει ως αποτέλεσμα την ενεργοποίηση της β-κατενίνης, που αποτελεί τον κύριο καθοδικό παράγοντα της σηματοδοτικής πορείας Wnt, γεγονός που επιβεβαιώθηκε με ανοσοαποτύπωμα για την έκφραση της β-κατενίνης. Επιπλέον, βρέθηκε ότι ο αναστολέας της β-κατενίνης, GSK-3β, απενεργοποιείται, ενώ ο θετικός ρυθμιστής της β-κατενίνης, Akt-1, ενεργοποιείται στα κύτταρα που υπερ-εκφράζουν το miR-9-5p. Ακόμη, τα επίπεδα των πρωτεϊνικών δεικτών της EMT, N-καντερίνης και βιμεντίνης, βρέθηκαν αυξημένα στα κύτταρα που υπερ-εκφράζουν το miR-9-5p, επιβεβαιώνοντας την ενεργοποίηση της διαδικασίας της EMT. Τέλος, για τη μελέτη του ρόλου του miR-9-5p στο NSCLC in vivo, κύτταρα Α549 και Η1299 που υπερ-εκφράζουν το miR-9-5p αλλά και τα αντίστοιχα κύτταρα ελέγχου εμβολιάσθηκαν υποδόρια σε ανοσοκατεσταλμένους μύες NSG για την ανάπτυξη ξενομοσχευμάτων. Η έκφραση του miR-9-5p οδήγησε στο σχηματισμό όγκων μεγαλύτερων κατά 2 φορές στα κύτταρα A549 και κατά 2,2 φορές στα κύτταρα Η1299 σε σύγκριση με τα αντίστοιχα κύτταρα ελέγχου, καταδεικνύοντας τον ογκογόνο ρόλο του miR-9-5p στο NSCLC in vivo. Συνοψίζοντας, η IKKα έχει ογκοκατασταλτική δράση στον NSCLC καταστέλλοντας την έκφραση του ογκογόνου miR-9-5p. Η παρούσα μεταπτυχιακή διατριβή καταδεικνύει το miR-9-5p ως ένα ογκογόνο miRNA στο NSCLC, όπου δρα στοχεύοντας την E-καντερίνη και επάγοντας την πορεία Akt-1/GSK-3β/β-κατενίνης, η οποία ρυθμίζει θετικά την ΕΜΤ, με αποτέλεσμα την αυξημένη διεισδυτική ικανότητα των κυττάρων και τελικά την ανάπτυξη του όγκου.
Ο καρκίνος του πνεύμονα αποτελεί το δεύτερο συχνότερο τύπο καρκίνου και την κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο παγκοσμίως. Παρά την ανάπτυξη νέων θεραπευτικών προσεγγίσεων, το ποσοστό πενταετούς επιβίωσης των ασθενών παραμένει χαμηλό λόγω της διάγνωσης σε προχωρημένα στάδια της νόσου αλλά και της εμφάνισης ανθεκτικότητας στη θεραπεία. Οι μεταγραφικοί παράγοντες (TFs) NF-κB δρουν επάγοντας ή καταστέλλοντας την έκφραση μιας μεγάλης ποικιλίας γονιδίων στόχων. Σε χρόνιες φλεγμονώδεις νόσους του πνεύμονα, καθώς και στον καρκίνο του πνεύμονα, η σηματοδοτική πορεία του NF-κΒ συχνά απορρυθμίζεται με αποτέλεσμα την ιδιοστατική ενεργοποίησή της. Η απορρύθμιση αυτή οδηγεί σε χρόνια φλεγμονή, προαγωγή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και της κυτταρικής επιβίωσης. Οι μεταγραφικοί παράγοντες NF-κB ρυθμίζουν την έκφραση γονιδίων που κωδικοποιούν πρωτεΐνες αλλά και μη κωδικά μόρια RNA, όπως τα microRNA (ή μικρά μόρια RNA), ωστόσο η σχέση μεταξύ NF-κB και miRNA δεν έχει ακόμη πλήρως αποσαφηνιστεί. Η ενεργοποίηση των μεταγραφικών παραγόντων NF-κB επιτυγχάνεται με δύο κύριες πορείες σηματοδότησης: την IKKβ-εξαρτώμενη κανονική σηματοδοτική πορεία, κατά την οποία τα ετεροδιμερή RelA/p65-p50 και cRel-p50 μετατοπίζονται στον πυρήνα όπου ρυθμίζουν την έκφραση γονιδίων-στόχων τους, και την IKKα-εξαρτώμενη μη κανονική πορεία του NF-κB κατά την οποία η πυρηνική μετατόπιση των ετεροδιμερών RelB/p52 προάγει την ενεργοποίηση ενός διαφορετικού συνόλου γονιδίων στόχων. Οι κινάσες σερίνης/θρεονίνης IKKβ και IKKα είναι οι κύριοι ανοδικοί ενεργοποιητές της κανονικής και μη κανονικής πορείας του NF-κΒ, αντίστοιχα, ωστόσο συχνά εμφανίζουν και δράσεις ανεξάρτητες από την ενεργοποίηση των μεταγραφικών παραγόντων NF-κΒ. Η IKKα εμφανίζει ογκοκατασταλτική δράση στον NSCLC, ανεξάρτητα από τη μη κανονική πορεία του NF-κB. Το εργαστήριο μας ανέπτυξε δυο μοντέλα NSCLC ποντικού και ανθρώπου in vivo, όπου η αποσιώπηση της IKKα οδήγησε στην ενεργοποίηση του μεταγραφικού παράγοντα HIF-1α, προάγοντας την ανάπτυξη όγκων σε συνθήκες υποξίας in vivo. Για την περαιτέρω διερεύνηση των μηχανισμών της ογκοκατασταλτικής δράσης της IKKα στον NSCLC, σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η μελέτη του προφίλ έκφρασης των miRNA σε κυτταρικές σειρές NSCLC μετά από την αποσιώπηση της IKKα και η μελέτη του πιθανού μηχανισμού δράσης τους. Για τη μελέτη των miRNA που ρυθμίζονται από την κινάση IKKα, χρησιμοποιήθηκε η κυτταρική σειρά NSCLC, A549, και αρχικά κατασκευάστηκε μια σταθερή κυτταρική σειρά με μειωμένα επίπεδα έκφρασης της IKKα (IKKα knockdown, IKKαKD). Στη συνέχεια απομονώθηκε ολικό RNA από κύτταρα ελέγχου και κύτταρα IKKαKD και αναλύθηκε η έκφραση των miRNA μέσω της τεχνολογίας Nanostring. Από τα διαφορικά εκφραζόμενα miRNA, το miR-9-5p παρουσίασε τη μεγαλύτερη αύξηση, κατά 2.13 φορές, στα κύτταρα ΙΚΚαKD σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου. Το miR-9-5p εμφανίζει ογκογόνο δράση σε διάφορους τύπους καρκίνου και η αυξημένη έκφρασή του έχει συσχετιστεί με προχωρημένα στάδια της νόσου καθώς και την ύπαρξη μεταστάσεων στον καρκίνο του πνεύμονα, ωστόσο ο μηχανισμός δράσης του δεν έχει μελετηθεί πλήρως. Επομένως, επιλέξαμε να μελετήσουμε τον ρόλο του miR-9-5p στο NSCLC και για το σκοπό αυτό κατασκευάστηκαν σταθερές κυτταρικές σειρές Α549 και Η1299 οι οποίες υπερ-εκφράζουν το miR-9-5p. Για τη διερεύνηση του ρόλου του miR-9-5p στην ανάπτυξη του NSCLC μελετήθηκε αρχικά η επίδραση του miR-9-5p στον πολλαπλασιασμό και την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου των καρκινικών κυττάρων in vitro. Η υπερ-έκφραση του miR-9-5p δεν είχε καμία στατιστικά σημαντική επίδραση στον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων, όπως καταδείχθηκε από τις καμπύλες ανάπτυξης και την ανάλυση του κυτταρικού κύκλου με κυτταρομετρία ροής. Αντίθετα, η υπερ-έκφραση του miR-9-5p οδήγησε σε σημαντική αύξηση της κυτταρικής διήθησης (cell invasion), υποδεικνύοντας ένα πιθανά σημαντικό ρόλο του miR-9-5p στη διαδικασία της επιθηλιακής προς μεσεγχυματικής κυτταρικής μετατροπής (epithelial to mesenchymal cell transition, EMT). Για την εύρεση πιθανών στόχων του miR-9-5p, αξιοποιήθηκε η βάση δεδομένων mirDIP, και από το σύνολο των πιθανών γονιδίων στόχων που ταυτοποιήθηκαν επιλέχθηκαν τα γονίδια που σχετίζονται με τη σηματοδοτική πορεία Wnt, μια από τις κύριες πορείες που ρυθμίζουν τη διαδικασία της EMT. Ολικά πρωτεϊνικά εκχυλίσματα αναλύθηκαν με ανοσοαποτύπωμα κατά Western για την έκφραση της Ε-καντερίνης, η οποία διαδραματίζει βασικό ρόλο στον σχηματισμό των συνδέσμων πρόσφυσης (adherens junctions) μεταξύ γειτονικών επιθηλιακών κυττάρων. Τα αποτελέσματα κατέδειξαν την κατακόρυφη μείωση των επιπέδων έκφρασης της Ε-καντερίνης μετά από την υπερ-έκφραση του miR-9-5p γεγονός που καταδεικνύει το γονίδιο CDH1 ως στόχο του miR-9-5p. H απώλεια της E-καντερίνης έχει ως αποτέλεσμα την ενεργοποίηση της β-κατενίνης, που αποτελεί τον κύριο καθοδικό παράγοντα της σηματοδοτικής πορείας Wnt, γεγονός που επιβεβαιώθηκε με ανοσοαποτύπωμα για την έκφραση της β-κατενίνης. Επιπλέον, βρέθηκε ότι ο αναστολέας της β-κατενίνης, GSK-3β, απενεργοποιείται, ενώ ο θετικός ρυθμιστής της β-κατενίνης, Akt-1, ενεργοποιείται στα κύτταρα που υπερ-εκφράζουν το miR-9-5p. Ακόμη, τα επίπεδα των πρωτεϊνικών δεικτών της EMT, N-καντερίνης και βιμεντίνης, βρέθηκαν αυξημένα στα κύτταρα που υπερ-εκφράζουν το miR-9-5p, επιβεβαιώνοντας την ενεργοποίηση της διαδικασίας της EMT. Τέλος, για τη μελέτη του ρόλου του miR-9-5p στο NSCLC in vivo, κύτταρα Α549 και Η1299 που υπερ-εκφράζουν το miR-9-5p αλλά και τα αντίστοιχα κύτταρα ελέγχου εμβολιάσθηκαν υποδόρια σε ανοσοκατεσταλμένους μύες NSG για την ανάπτυξη ξενομοσχευμάτων. Η έκφραση του miR-9-5p οδήγησε στο σχηματισμό όγκων μεγαλύτερων κατά 2 φορές στα κύτταρα A549 και κατά 2,2 φορές στα κύτταρα Η1299 σε σύγκριση με τα αντίστοιχα κύτταρα ελέγχου, καταδεικνύοντας τον ογκογόνο ρόλο του miR-9-5p στο NSCLC in vivo. Συνοψίζοντας, η IKKα έχει ογκοκατασταλτική δράση στον NSCLC καταστέλλοντας την έκφραση του ογκογόνου miR-9-5p. Η παρούσα μεταπτυχιακή διατριβή καταδεικνύει το miR-9-5p ως ένα ογκογόνο miRNA στο NSCLC, όπου δρα στοχεύοντας την E-καντερίνη και επάγοντας την πορεία Akt-1/GSK-3β/β-κατενίνης, η οποία ρυθμίζει θετικά την ΕΜΤ, με αποτέλεσμα την αυξημένη διεισδυτική ικανότητα των κυττάρων και τελικά την ανάπτυξη του όγκου.
Περιγραφή
Λέξεις-κλειδιά
lung cancer, microRNA, miR-9-5p, IKKα
Θεματική κατηγορία
Παραπομπή
Σύνδεσμος
Γλώσσα
en
Εκδίδον τμήμα/τομέας
Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων. Σχολή Επιστημών Υγείας. Τμήμα Ιατρικής
Όνομα επιβλέποντος
Κωλέττας, Ευάγγελος
Εξεταστική επιτροπή
Κωλέττας, Ευάγγελος
Φριλίγγος, Ευστάθιος
Παπαμαρκάκη, Θωμαΐς
Παναγιώτης, Κούκλης
Γεωργιάδου, Μαρία
Φριλίγγος, Ευστάθιος
Παπαμαρκάκη, Θωμαΐς
Παναγιώτης, Κούκλης
Γεωργιάδου, Μαρία
Γενική Περιγραφή / Σχόλια
Ίδρυμα και Σχολή/Τμήμα του υποβάλλοντος
Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων. Σχολή Επιστημών Υγείας
Πίνακας περιεχομένων
Contents
Acknowledgements 2
Summary 5
Περίληψη 7
1. Introduction 10
1.1. Lung cancer and its molecular mechanisms 10
1.1.1. Genetic changes in lung cancer 10
1.1.2. Epigenetic changes in lung cancer 12
1.2. The role miRNAs in cancer regulation 13
1.2.1. MicroRNA biogenesis 14
1.2.2. MiRNA mechanism of action 15
1.2.3. MiRNAs in cancer 16
1.2.4. MiRNAs in lung cancer 17
1.2.5. MiR-9-5p in cancer 18
1.2.6. MiR-9-5p in lung cancer 21
1.2.7. MiRNAs as therapy targets 22
1.3. The NF-κB pathway in cancer 23
1.3.1 NF-κB signalling in lung cancer 25
Aims 28
2. Materials and Methods 29
2.1. Bacterial cell methods 29
2.1.1. Preparation of L-broth (Luria-Bertani; LB) and L-agar plates 29
2.1.2. Preparation of competent bacteria 29
2.1.3. Bacterial Transformation with plasmid DNA 30
2.1.4. Isolation of Plasmid DNA on a Small Scale (Mini Prep) 30
2.1.5. Isolation of Plasmid DNA on a Large Scale (Midi Prep) 30
2.2. Tissue culture methods 31
2.2.1. Cell culture 31
2.2.2. Cryopreservation of cell lines 31
2.2.3. Stable cell line generation 31
2.2.4. Cell Proliferation Assay 34
2.2.5. Flow cytometry (FACs) for cell cycle analysis 34
2.2.6. Matrigel Invasion Assay 35
2.2.7. Tumour xenografts 35
2.3. Molecular and Biochemical methods 36
2.3.1. RNA Isolation 36
2.3.2. Total RNA extraction from mouse xenografts 36
2.3.2. Nanostring Analysis – miRNome profiling 36
2.3.3. cDNA synthesis 36
2.3.4. Quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR) 37
2.3.5. Target Prediction Algorithms 37
2.3.6. Total Protein Extraction 37
2.3.7. Total protein Isolation from mouse xenografts 38
2.3.8. Western Blotting 38
2.4. Statistical Analysis 39
3. Results 40
3.1. Nanostring analysis of IKKαKD cell lines 40
3.2. Generation of miR-9-5p overexpression cell lines 42
3.3. miR-9-5p effect on cell proliferation, cell cycle and invasion in vitro 43
3.4. Predicted targets of miR-9-5p 45
3.5. miR-9-5p targets E-Cadherin in LUAD 47
3.6. miR-9-5p overexpression promotes tumour formation in vivo 49
4. Discussion 52
4.1. Introduction 52
4.2. IKKα loss induces miR-9-5p expression 53
4.3. MiR-9-5p targets in NSCLC 53
4.3.1. EMT and cancer 54
4.3.2. Wnt signalling pathway 55
4.4. miR-9-5p targets CDH1 in lung cancer 58
4.5. miR-9-5p promotes tumour growth in vivo 59
4.6. Conclusions 60
References 61
Χορηγός
Βιβλιογραφική αναφορά
Ονόματα συντελεστών
Αριθμός σελίδων
75 σ.
Λεπτομέρειες μαθήματος
item.page.endorsement
item.page.review
item.page.supplemented
item.page.referenced
Άδεια Creative Commons
Άδεια χρήσης της εγγραφής: Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 United States