Μελέτη των Τ ρυθμιστικών κυττάρων σε συγγενείς ατόμων με σακχαρώδη διαβήτη τύπου 1

Μικρογραφία εικόνας

Αρχεία

Δ.Δ. ΠΕΤΣΙΟΥ ΑΣΗΜΙΝΑ Ν. 2016.pdf (4.56 MB)

Ημερομηνία

2016

Συγγραφείς

Πέτσιου, Ασημίνα Ν.

Τίτλος Εφημερίδας

Περιοδικό ISSN

Τίτλος τόμου

Εκδότης

Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων. Σχολή Επιστημών Υγείας. Τμήμα Ιατρικής

Περίληψη

Τύπος

doctoralThesis

Είδος δημοσίευσης σε συνέδριο

Είδος περιοδικού

Είδος εκπαιδευτικού υλικού

Όνομα συνεδρίου

Όνομα περιοδικού

Όνομα βιβλίου

Σειρά βιβλίου

Έκδοση βιβλίου

Συμπληρωματικός/δευτερεύων τίτλος

Περιγραφή

Πρωτεύοντα ρόλο στη διατήρηση της ομοιοστασίας του ανοσοποιητικού συστήματος έχουν τα Τρυθμ λεμφοκύτταρα που αποτελούν έναν από τους κύριους μεσολαβητές της «περιφερικής ανοχής». Μετά τον αρχικό ενθουσιασμό και την εγκατάλειψη της έννοιας των κατασταλτικών Τ κυττάρων (Tsuppressor), η χρήση του μορίου CD25 (αλυσίδα α του υποδοχέα της IL-2) σε συνδυασμό με τον υποδοχέα της IL-7 ( CD127 ) συνέβαλαν σημαντικά στον προσδιορισμό του υποπληθυσμού των Τ ρυθμ. Ορόσημο στη μελέτη των Τρυθμ αποτέλεσε η ανακάλυψη του μεταγραφικού παράγοντα FoxP3 (forkhead box P3, winged helix transcription factor), του οποίου η μετάλλαξη σχετίζεται με απουσία Τρυθμ και κλινική εικόνα αυτοανοσίας στα ποντίκια και το σύνδρομο IPEX στους ανθρώπους, ενώ σημαντική είναι η αρνητική συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης του CD127 και της παρουσίας του FoxP3. Η παραγωγή και διαφοροποίηση των Τρυθμ επιτελείται όπως σε όλα τα κύτταρα Τ. Με βάση το σημείο διαφοροποίησής τους τα Τρυθμ διακρίνονται στα tTregs (thymus derived Tregs) και στα pTregs (peripherally derived Tregs). Ο ακριβής μηχανισμός δράσης των Τρύθμ δεν είναι ξεκάθαρος αλλά φαίνεται οτι η αλληλεπίδραση με τα Τδραστ είναι αδιαμφισβήτητη. In vivo η ενεργοποίηση των Τδραστ συνεπάγεται την ενεργοποίηση των Τρυθμ, τα οποία οδηγούν σε συσσώρευση μορίων όπως το cAMP, το CTLA-4, τα HLA-DR/DQ, ο TGF-β, η IL-2 και η αδενοσίνη. Ο ρόλος των Τρυθμ είναι σημαντικός, καθώς φαίνεται η δράση του να είναι απαραίτητη για τη διατήρηση της ισορροπίας, σε μια ζυγαριά που από τη μια βρίσκονται τα αυτοάνοσα νοσήματα και από την άλλη οι λοιμώξεις και ο καρκίνος. Μια νεότερη προσέγγιση στα ανθρώπινα Τρυθμ είναι αυτή που παρουσιάστηκε από την ομάδα του Shimon Sakaguchi το 2009. Οι Miyara και συνεργάτες απέδειξαν ότι από το συνδυασμό του CD25 και του CD45RA στα CD4+ κύτταρα T προκύπτουν έξι τουλάχιστον υποπληθυσμοί, εκ των οποίων οι τρεις εκφράζουν FoxP3 σε διαφορετικά επίπεδα [21]. Σύμφωνα με τους συγγραφείς τα FoxP3+ κύτταρα Τ δεν αποτελούν ένα λειτουργικά και φαινοτυπικά ενιαίο πληθυσμό και με βάση την έκφραση του CD25 και του CD45RA (ή CD45RO, του οποίου η έκφραση σε όλα τα κύτταρα Τ, συμπεριλαμβανομένων και των Τρυθμ είναι αλληλο- αποκλειόμενη με αυτή του CD45RA), μπορούν να διακριθούν σε 3 υποπληθυσμούς : τα ενεργοποιημένα Τρυθμ (activated-, aTregs) που έχουν φαινότυπο CD45RA_FoxP3high CD4+ (πληθυσμός II), τα μη ενεργοποιημένα (resting-, rTregs) με φαινότυπο CD45RA+FoxP3lowCD4+ (πληθυσμός I), και τα μη κατασταλτικά (non-Tregs) με φαινότυπο CD45RA~FoxP3mtCD4+ (πληθυσμός III, int = intermediate/ ενδιάμεση). Κατ'εξοχήν κατασταλτική/ ρυθμιστική δράση ασκούν τα aTregs ενώ τα rTregs έχουν το ήμισυ τέτοιας δραστηριότητας, με τους υπόλοιπους πληθυσμούς (III-VI) να μην επιδεικνύουν καθόλου ρυθμιστική ή κατασταλτική δράση. Ο διαχωρισμός στους υποπληθυσμούς αυτούς, υποδεικνύει τις διαφορετικές πορείες διαφοροποίησης των κυττάρων αυτών. Ο σακχαρώδης διαβήτης (ΣΔ) είναι μια κλινική νόσος που χαρακτηρίζεται από σχετική ή απόλυτη ανεπάρκεια έκκρισης ινσουλίνης και συνακόλουθη έλλειψη ευαισθησίας ή αντίσταση στην μεταβολική δράση της ινσουλίνης στους ιστούς-στόχους. Οι δύο μεγάλες κατηγορίες του ΣΔ καθορίζονται ως τύπος 1 και τύπος 2 και ειδικότερα οι ασθενείς με τύπου 1 σακχαρώδη διαβήτη έχουν λίγη ή καθόλου ενδογενή έκκριση ινσουλίνη. Δείκτες της αυτοάνοσης διεργασίας στον ΣΔ1 είναι τα νησιδιακά αυτοαντισώματα. Ο κατάλογος των νησιδιακών αυτοαντισωμάτων είναι μεγάλος. Φαίνεται να υπάρχει συσχέτιση των αυτοαντισωμάτων με την πρόβλεψη της νόσου σε υγιή άτομα και αυτό έχει να κάνει κυρίως 164 με τον αριθμό των αυτοαντισωμάτων. Γενικώς ο αριθμός των αυτοαντισωμάτων που εκφράζει ένα άτομο με προδιάθεση για ΣΔ1 είναι πιο σημαντικός από οποιονδήποτε συνδυασμό αυτοαντισωμάτων. Όσον αφορά τους προδιαθεσικούς παράγοντες για την εμφάνιση ΣΔ1, το ενδιαφέρον έχει στραφεί στην αναζήτηση γονιδίων που προδιαθέτουν στην εμφάνιση ΣΔ1 στην περιοχή HLA (στην οποία βρίσκονται αλληλόμορφα που ευθύνονται για το 40-50% του γενετικού κινδύνου εμφάνισης ΣΔ) καθώς και στην περιοχή του προαγωγέα της ινσουλίνης (INS- VNTR) και στο γονίδιο CTLA-4. Αν και παλαιότερα, τα HLA-DRB1*03 (DR3) και HLA- DRB1*04 (DR4) είχαν βρεθεί ως τα κύρια αλληλόμορφα που σχετίζονται με τη νόσο, μεταγενέστερες μελέτες έδειξαν ότι η περιοχή που σχετίζεται με υψηλό κίνδυνο εμφάνισης (αλλά και προστασία από) ΣΔ1 είναι η περιοχή HLA-DQ. Επιπλέον, θεωρείται ότι περιβαλλοντικοί παράγοντες εκκινούν μια αυτοάνοση διεργασία στο πάγκρεας σε ένα γενετικά προδιατιθέμενο άτομο, που έχει ως αποτέλεσμα την καταστροφή των ινσουλινοεκκριτικών κυττάρων β. Ειδικότερα, ιογενείς λοιμώξες (εντεροϊοί), διαιτητικοί παράγοντες (βιταμίνη D, γάλα αγελάδος), η ύπαρξη stress φαίνεται να συμβάλλουν σε διαταραχή της ομοιοστασίας του ανοσοποιητικού συστήματος που θα μπορούσε να σχετίζεται με επιρρέπεια στην εμφάνιση του ΣΔ1. Αρχικά, μελέτες του ποσοστού των Τρυθμ σε διαβητικούς τύπου 1 ανέφεραν μείωση του αριθμού τους, γεγονός που δεν επιβεβαιώθηκε σε μελέτες που ακολούθησαν, γεγονός που αποδώθηκε σε έλλειψη ειδικών δεικτών για τον προσδιορισμό των Τρυθμ. Στις μελέτες όμως αυτές επισημάνθηκε μειωμένη λειτουργικότητα των Τρυθμ. Η χρήση νέων δεικτών, όπως η έκφραση FoxP3 και ταυτόχρονα η χαμηλή έκφραση CD127 [167], η έκφραση του μεταγραφικού παράγοντα Helios και η απομεθυλίωση TSDR [172], καθώς και ο διαχωρισμός σε υποπληθυσμούς Τρυθμ με βάση την έκφραση CD45RA [173] δεν ανέδειξε διαφοροποιήσεις στον αριθμό/ποσοστό των Τρυθμ στον ΣΔ1, αν και μια παροδική μείωση φαίνεται να υπάρχει στους νεοδιαγνωσθέντες διαβητικούς. Ιδιαίτερη αναφορά πρέπει να γίνει στη μελέτη των Ferraro και συν, οι οποίοι εργάστηκαν εκτός από το περιφερικό αίμα και σε λεμφαδένες παγκρέατος διαβητικών τύπου 1 όπου και αποδείχθηκε αύξηση των Th17 κυττάρων και απώλεια της έκφρασης Foxp3 και της ρυθμιστικής ικανότητας των Τρυθμ στους τοπικούς λεμφαδένες (παρά τη διατήρηση της απομεθυλίωσης TSDR). Το γεγονός αυτό, δεν παρατηρήθηκε αντίστοιχα στο περιφερικό αίμα των ίδιων ατόμων [177]. Οι συγγενείς ατόμων με σακχαρώδη διαβήτη αποτελούν μια ομάδα ανθρώπων με αυξημένο κίνδυνο να εκδηλώσουν τη νόσο. Αυτός ο κίνδυνος σχετίζεται ισχυρά με την έκφραση αυτοαντισωμάτων, τα οποία συνδέονται με την έναρξη της αυτοάνοσης διεργασίας, χωρίς ωστόσο να την προκαλούν. Δεδομένου ότι η νόσος έχει ισχυρό γενετικό υπόβαθρο, η μελέτη ύποπτων γονιδίων στα άτομα υψηλού κινδύνου, όπως οι συγγενείς πρώτου βαθμού αποτέλεσε αντικείμενο μελέτης σε πλήθος ερευνών. Σκοπός της μελέτης: Σκοπός της διατριβής ήταν η μελέτη των ποσοτικών και ποιοτικών χαρακτηριστικών των Τ ρυθμιστικών λεμφοκυττάρων σε συγγενείς ασθενών με ΣΔ1 σε σύγκριση με υγιείς εθελοντές. Σκοπός, επίσης ήταν να αναδειχθεί αν καθ’οιονδήποτε τρόπο, κάποια από τα χαρακτηριστικά των Τρυθμ σε συγγενείς ατόμων με ΣΔ1, μπορούν να προδιαθέσουν για εκδήλωση της νόσου. Υλικά και Μέθοδοι: Στη μελέτη συμμετείχαν 38 πρώτου βαθμού συγγενείς ατόμων με ΣΔ1 και 45 εθελοντές υγιείς μάρτυρες (μέσης ηλικίας, 31.6 ± 14 έτη) χωρίς προβλήματα υγείας ή οικογενειακό ιστορικό αυτοανοσίας. Στους πρώτου βαθμού συγγενείς περιλαμβάνονταν 17 αδέρφια (ηλικίας 22.7 ± 10.4 έτη), 5 παιδιά (ηλικίας ήταν 28.2 ± 2 έτη), 9 μητέρες (μέσης ηλικίας 36.4 ± 7.8) και 7 πατέρες (μέσης ηλικίας 46 ± 7.8). Στα άτομα αυτά έγινε λήψη περιφερικού αίματος με στόχο την ανάλυση δειγμάτων με κυτταρομετρία ροής και τον προσδιορισμό HLA. Η επεξεργασία των κυττάρων για κυτταρομετρία ροής εκτελούνταν άμεσα μετά την λήψη του δείγματος αίματος και χρησιμοποιήθηκαν τα ακόλουθα μονοκλωνικά αντισώματα με στόχο τη διενέργεια κυτταρομετρίας ροής τετραπλού φθορισμού : CD2 FITC , CD4 PERCP, CD11a FITC, CD25 APC, CD27 FITC, CD28 FITC, CD44 FITC, CD45RO FITC/ PE, CD54 PE, CD58 PE, CD74 PE, CD81, CD95, CD122 PE/ FITC, CD127 PE, CD132 PE, CD152 PE, CD178 PE, CD221 PE, Alexa Fluor488 FoxP3, CLIP PE, HLA-DR PE/ FITC, HLA-DQ FITC, TCRα/β FITC, TGF-β PE, TGF^RII. Χρησιμοποιώντας το λογισμικό ανάλυσης Cell Quest (Becton Dickinson) έγινε ανάλυση του τελικού εναιωρήματος στον κυτταρομετρητή ροής έως ότου καταμετρηθούν τουλάχιστον 10.000 CD4+ λεμφοκύτταρα T. Ο καθορισμός των Τρυθμ βασίστηκε στην έκφραση των μορίων CD 127 και CD25 με βάση τον ανοσοφαινότυπο CD4lowCD25highCD127"/low Με βάση τα ιστογράμματα έκφρασης διαφόρων μορίων που θεωρήθηκαν σημαντικά για την ποιοτική ανάλυση των Τρυθμ, μελετήσαμε την έκφρασή τους στους τρεις υποπληθυσμούς των CD4+ λεμφοκυττάρων Τ: τα Τρυθμ, τα Τδραστ και τα Τπαρθ. Τα όρια θετικότητας ορίστηκαν με βάση τον αρνητικό μάρτυρα δηλαδή IgG1/IgG2a ποντικού. Ειδικότερα, θεωρήθηκε θετικό οτιδήποτε βρίσκεται πάνω από το 99,5% του ισοτυπικού μάρτυρα και με βάση αυτά τα όρια εκτιμήθηκε το ποσοστό των θετικών κυττάρων καθώς και η μέση ένταση φθορισμού. Επιπλέον έγινε προσδιορισμός των μορίων ιστοσυμβατότητας HLA-DR/DQ στους φυσιολογικούς μάρτυρες και τον υπό μελέτη πληθυσμό συγγενών ατόμων με ΣΔ1. Η στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων έγινε με το λογισμικό Statistical Package for Social Sciences Version 17.0 for windows (SPSS v. 17.0). Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέση τιμή (mean) ± σταθερά απόκλιση (standard deviation, SD). Για σύγκριση των μέσων τιμών μεταξύ των διαφόρων ομάδων ατόμων ή κυττάρων, έγινε χρήση του two- tailed Student’s t test. Οι συσχετίσεις μεταξύ διαφορετικών παραμέτρων ελέγχθηκαν με το Pearson’s test. Στατιστικά σημαντικά θεωρήθηκαν τα αποτελέσματα με τιμή p < 0,05, ενώ στην περίπτωση του Pearson’s test παρουσιάζεται και ο συντελεστής συσχέτισης r (correlation coefficient) και ο συντελεστής r2 (coefficient of determination). Αποτελέσματα: Αρχικά, αντικείμενο της μελέτης, υπήρξε η τεκμηρίωση του τρόπου προσδιορισμού των Τρυθμ με βάση τον ανοσοφαινότυπο CD4lowCD25highCD127"/low Τα Τρυθμ που διαχωρίσαμε βρέθηκε να εκφράζουν τον μεταγραφικό παράγοντα FoxP3 σε ποσοστό 89,9±5,4%. Επιβεβαιωτική για την έλλειψη υποκειμενισμού στον τρόπο προσδιορισμού των Τρυθμ, είναι η υψηλή συσχέτιση (r = 0,865) του ποσοστού των Τρυθμ με αυτό που καθορίσαμε ως πληθυσμό επιβεβαίωσης και αντιστοιχεί στο ποσοστό των CD127"/low στο κορυφαίο 7% των CD4+ λεμφοκυττάρων T ως προς την έκφραση του CD25, στο κυτταρόγραμμα CD4-CD25. Ακολούθως μελετήθηκε και βρέθηκε στατιστικά σημαντική η συσχέτιση του ποσοστού των Τρυθμ με τους υποπληθυσμούς βάσει της τεχνικής Miyara και συνεργατών 2009. Στη συνέχεια έγινε σύγκριση του ποσοστού των Τρυθμ μεταξύ των συγγενών πρώτου βαθμού διαβητικών τύπου 1 και φυσιολογικών μαρτύρων και καμιά στατιστικά σημαντική ποσοτική διαφορά δεν αναδείχθηκε. Ομοίως δε διαπιστώθηκε στατιστικώς σημαντική διαφοροποίηση ως προς τα ποσοστά των τριών υποπληθυσμών των CD4+FoxP3+ κυττάρων Τ με βάση την τεχνική Miyara και συνεργατών 2009, μεταξύ συγγενών και φυσιολογικών μαρτύρων, για κανένα από τους υποπληθυσμούς και σε καμιά από τις ομάδες των συγγενών. Στατιστικά σημαντικές διαφορές παρατηρήθηκαν κατά την έκφραση δεικτών επιφανείας στα Τρυθμ σε σύγκριση με τα Τδραστ και τα Τπαρθ. Ειδικότερα, τα Τρυθμ εκφράζουν σε 166 μεγαλύτερο ποσοστό και με μεγαλύτερη MFI τους ακόλουθους δέικτες: CD122, HLADR, HLA-DQ ,CD74, CLIP, CD95 και CD152 (επιφανειακή και ενδοκυττάρια έκφραση) καθώς και τις συνεκφράσεις CD122/CD132, HLA-DR/CLIP, HLA-DR/HLA-DQ και CD28/CD152 σε σχέση με τα Τδραστ και Τπαρθ. Επίσης, εκφράζουν σε μεγαλύτερο ποσοστό το CD27 σε σύγκριση με τα Τδραστ ενώ εμφανίζουν υψηλότερη μέση ένταση φθορισμού για την αλυσίδα γ του υποδοχέα της IL-2 (CD132) σε σχέση με τα Τπαρθ. Τέλος παρατηρήθηκε χαμηλότερη έκφραση του TGF^RII και του CD178 στα Τρυθμ σε σχέση με τα Τδραστ. Στη συνέχεια έγινε μελέτη των διαφορών έκφρασης των δεικτών αυτών μεταξύ πρώτου βαθμού συγγενών διαβητικών και φυσιολογικών μαρτύρων. Σε όλες τις ανωτέρω περιπτώσεις οι συγκρίσεις απέδειξαν πολύ λίγες περιπτώσεις στατιστικώς σημαντικών διαφορών. Συγκεκριμένα, οι περισσότερες αποκλίσεις αφορούσαν τα αδέλφια διαβητικών ατόμων όπου παρατηρήθηκαν στατιστικώς σημαντικές μειώσεις (με πολύ λίγες εξαιρέσεις σημαντικών αυξήσεων) στα ακόλουθα: του ποσοστού μεμβρανικής έκφρασης TGF-β στα Τρυθμ και Τπαρθ και της MFI στα Τρυθμ και Τδραστ, του ποσοστού έκφρασης HLA-DR στα Τρυθμ και Τδραστ και της MFI στα Τπαρθ, της MFI του μορίου CD28 στα Τρυθμ και τα Τπαρθ, της MFI του μορίου CD27 στα Τδραστ και Τπαρθ καθώς και του ποσοστού CD95+ Τπαρθ κυττάρων. Αντίθετα, υπήρξε αύξηση στην MFI του μορίου CD152 στα Τδραστ και τα Τπαρθ. Οι μητέρες είχαν χαμηλό ποσοστό έκφρασης TGF-β στα Τρυθμ και Τπαρθ, καθώς και χαμηλή MFI στα Τπαρθ. Οι πατέρες παιδιών με ΣΔ1 εμφάνισαν χαμηλό ποσοστό έκφρασης CD122 στα κύτταρων Τδραστ, ενώ εμφάνισαν υψηλό ποσοστό έκφρασης CD132 στα Τρυθμ, καθώς και υψηλή MFI του μορίου αυτού σε Τδραστ και Τπαρθ, και υψηλή MFI του μορίου CD74 στα Τρυθμ. Τέλος, τα παιδιά διαβητικών που ήταν και το μικρότερο δείγμα, εμφάνισαν μειωμένη MFI του μορίου CD122 στα Τπαρθ και του μορίου CD132 στα Τρυθμ. Όσον αφορά την κατανομή των γονοτύπων HLA-DR και HLA-DQ στους συγγενείς ατόμων με ΣΔ1, βλέπουμε ότι κανένα άτομο από το δείγμα μας (μάρτυρες και συγγενείς), δεν εμφανίζει τον πολύ υψηλού κινδύνου συνδυασμό HLA-DR3/ HLA-DR4, αλλά η παρουσία ενός μόνο αλληλόμορφου (και ειδικότερα του HLA-DR3) που αποτελεί παράγοντα κινδύνου είναι αυξημένη στους συγγενείς και ειδικότερα στους πατέρες σε σχέση με τους φυσιολογικούς μάρτυρες. Κατ'αντιστοιχεία κανένα άτομο από το δείγμα μας (μάρτυρες και συγγενείς), δεν εμφανίζει τον πολύ υψηλού κινδύνου γονότυπο HLA- DQB 1*02/DQB 1*0302, αλλά ο σχετικά χαμηλού κινδύνου (αλλά με αυξημένο ποσοστό σε σύγκριση με τους άλλους συνδυασμούς), γονότυπος HLA- DQB1*02/y βρέθηκε συχνότερα στους συγγενείς σε σχέση με τους φυσιολογικούς μάρτυρες. Κατά την προσπάθεια συσχέτισης μεταξύ γονοτύπου και ποσοστού Τρυθμ δε βρέθηκε να υπάρχουν στατιστικά σημαντικές διαφοροποιήσεις του ποσοστού των Τρυθμ ανάλογα με τον γονότυπο HLA-DR, HLA-DQ με εξαίρεση μια στατιστικά σημαντική μείωση του ποσοστού των Τρυθμ στα άτομα που φέρουν τον γονότυπο nonDR3/nonDR4, σε σχέση με τα άτομα που φέρουν μόνο το προδιαθετικό αλληλόμορφο HLA-DR3. Τέλος, με βάση το διαχωρισμό κατά Miyara και συν. 2009, έγινε περαιτέρω μελέτη των χαρακτηριστικών των υποπληθυσμών των Τρυθμ. Επιβεβαιώνοντας τη διακύμανση της έκφρασης του FoxP3 που αναφέρεται στη βιβλιογραφία, αναδείξαμε επιπλέον ότι τα ενεργοποιημένα Τρυθμ (a Tregs- II) είναι CD127low/- ενώ τα rTregs (πληθυσμός I) είναι CD127high/ow και τα μη κατασταλτικά CD4+FoxP3+ κύτταρα Τ (πληθυσμός III) είναι ^ 2y high/low/- Κατά τη μελέτη της έκφρασης του CD2 στους υποπληθυσμούς των Τρυθμ παρατηρούμε ότι παρόλο που όλοι οι υποπληθυσμοί εκφράζουν το μόριο CD2, τα rTregs (πληθυσμός I) έχουν σχεδόν τη μισή μέση ένταση φθορισμού σε σχέση με τους άλλους δύο υποπληθυσμούς. Επιπλέον, η μέση έκφραση φθορισμού του μορίου CD4, είναι χαμηλότερη στους υποπληθυσμούς I και II χωρίς να υπάρχει σημαντική διαφορά μεταξύ aTregs και σε rTregs. Η μελέτη της έκφρασης του HLA-DR στους υποπληθυσμούς των Τρυθμ σε φυσιολογικούς μάρτυρες ανέδειξε ότι τα aTregs είναι στην πλειοψηφία τους HLA-DR+ (από 62-94 %), ενώ τα rTregs είναι κυρίως HLA-DR" (93,3- 98,2%). Το ίδιο ισχύει και με τη μέση ένταση φθορισμού, η οποία στα aTregs είναι η υψηλότερη σε σχέση με όλα τα CD4+ λεμφοκύτταρα Τ. Παρόμοια διακύμανση έχει και η έκφραση του CD122 στους τρεις υποπληθυσμούς των CD4+FoxP3+ κυττάρων Τ με τα aTregs να έχουν και εδώ την υψηλότερη έκφραση αυτού του δείκτη. Κατά τη μελέτη της έκφρασης του CD81 παρατηρούμε ότι τα aTregs εμφανίζουν σημαντικά μειωμένη μέση ένταση φθορισμού σε σχέση με τα υπόλοιπα Τρυθμ. Tέλος, τα aTregs έχουν χαμηλή ένταση φθορισμού στο 42% των κυττάρων που εκφράζουν το δείκτη CD221 και τα αντίστοιχα θετικά ως προς την έκφραση του CD221 rTregs (85%) έχουν ενδιάμεση ένταση στην έκφραση του δείκτη αυτού. Συμπεράσματα: Στη παρούσα μελέτη μελετήθηκε η κατάσταση των Τρυθμ σε συγγενείς ατόμων με ΣΔ1. Η εργασία μας καθιερώνει τρόπο επιλογής των Τρυθμ βασισμένο σε τρίχρωμο φθορισμό και δείχνει πως η χρήση του CD127 ως τρίτου δείκτη μετά τα CD4/CD25 προσθέτει στην ακρίβεια υπολογισμού των Τρυθμ. Ωστόσο ο διαχωρισμός και η μελέτη με το πρωτόκολλου τρίχρωμου φθορισμού των Miyara και συν. 2009 εγείρει υποψίες για την ομοιογένεια του πληθυσμού που καθορίζεται με τη χρήση των κλασσικών μορίων CD127/ FoxP3. Η μελέτη του ποσοστού των Τρυθμ σε συγγενείς ατόμων με ΣΔ1 (αδέλφια, μητέρες, πατέρες και παιδιά) δεν έδειξε κάποια στατιστικώς σημαντική διαφορετική κατανομή αυτού του πληθυσμού σε κάποια από τις πιο πάνω κατηγορίες καθώς επίσης και των τριών υποπληθυσμών των Τρυθμ που εκφράζουν την πρωτεΐνη FoxP3, όπως διαχωρίζονται με βάση την τεχνική Miyara και συν. 2009, χωρίς επίσης να αναδείξει καμιά διαφορά. Αυτό αποκτά ακόμη μεγαλύτερη σημασία αν αναλογιστούμε ότι περισσότεροι από τους μισούς συγγενείς των ατόμων με ΣΔ1 είχαν τουλάχιστον ένα αλληλόμορφο HLA-DR/DQ το οποίο να προδιαθέτει για ΣΔ1. Στη συνέχεια έγινε έλεγχος της έκφρασης διαφόρων δεικτών κυτταρικής επιφάνειας σε Τρυθμ, Τδραστ και Τπαρθ σε φυσιολογικά άτομα και τους συγγενείς ατόμων με ΣΔ1. Καταγράφηκαν σημαντικά χαρακτηριστικά των Τρυθμ σε φυσιολογικά άτομα όπως π.χ. η εκτεταμένη έκφραση CD122 και HLA-DR από τα Τρυθμ, αλλά καθόλου από τα ηρεμούντα. Η εκτεταμένη ανάλυση των χαρακτηριστικών αυτών σε συγγενείς διαβητικών ατόμων έδειξε λίγες μόνο αποκλίσεις, η μεγάλη πλειοψηφία των οποίων αφορούσε σε αδέλφια ατόμων με ΣΔ1. Μια σειρά μορίων εκφράζονται σε χαμηλότερα ποσοστά κυττάρων ή MFI στα Τρυθμ ή/ και Τδραστ, αλλά οι δύο αυτές κατηγορίες κυττάρων έχουν υψηλή MFI του μορίου CD152 (CTLA-4). Από την κατανομή των αλληλόμορφων ιστοσυμβατότητας τάξης II προκύπτει αυξημένη συχνότητα του HLA-DR3 στον γενικό πληθυσμό και αρκετά μεγαλύτερη στατιστικώς σημαντική στους πληθυσμούς των συγγενών διαβητικών ατόμων. Αντίστοιχη κατανομή υπάρχει και για τα HLA-DQB1*02 και -DQB1*0302, τα οποία είναι και στον Ελληνικό πληθυσμό σε ανισορροπία σύνδεσης με τα -DR3 και -DR4, αντίστοιχα. Η μελέτη των Miyara και συν. η οποία εμφανίστηκε τον !ούνιο του 2009 μας υποχρέωσε να μελετήσουμε ορισμένα χαρακτηριστικά των Τρυθμ και σύμφωνα με τον συγκεκριμένο τρόπο ανάλυσης, ο οποίος καθιερώνεται αργά μεν αλλά σταθερά. Αφ’ ενός δείξαμε ότι όντως προκύπτει ο ίδιου τύπου διαχωρισμός, και το ίδιο σχήμα έκφρασης του μεταγραφικού παράγοντα FoxP3. Aφ’ ετέρου, φάνηκε η διαφορετική έκφραση των πληθυσμών I, II και III ως προς την έκφραση του CD127. Σε συνδυασμό με το γεγονός ότι ο πληθυσμός III βρέθηκε να μην διαθέτει καθόλου ρυθμιστικές ικανότητες, ενώ η πολύ μεγάλη πλειοψηφία των κυττάρων του εκφράζουν λίγο έως καθόλου CD127 (CD127low/"), κατανοούμε το σφάλμα του διαχωρισμού των κυττάρων σε Τρυθμ και Τδραστ με βάσει την υψηλή έκφραση CD25 και την χαμηλή έως καθόλου έκφραση CD127. Επιπλέον, η εργασία μας επιβεβαιώνει παλαιότερες αναφορές που υποδεικνύουν ότι τα ανθρώπινα aTregs είναι HLA-DR+ και αποτελούν τον πιο ενεργό υποπληθυσμό των Τρυθμ καθώς η πλειοψηφία αυτών εκφράζουν εκτός από το HLA-DR+ και το IL-2Rαβγc+, ενώ τα rTregs είναι HLA-DR" και IL-2Rβ_. Επομένως τα aTregs είναι λειτουργικώς έτοιμα να χρησιμοποιήσουν προς οφελός τους την IL-2 που παράγεται από τα ενεργοποιημένα CD4 Τδραστ. Η διαφορά μεταξύ aTregs και rTregs επεκτείνεται και σε χαρακτηριστικά που τα διαχωρίζουν από τα υπόλοιπα CD4+ κύτταρα T, όπως για παράδειγμα στη χαμηλότερη μεμβρανική έκφραση των μορίων CD2, CD4, CD11a, CD58, CD81 (όλα τους εμπλεκόμενα στην ανοσολογική σύναψη), καθώς και των υποδοχέων αυξητικών παραγόντων CD127 και CD221.
Regulatory T cells are considered to have a primary role in maintaining theimmune homeostasis. A hallmark in Tregs is the high expression of the transcription factor,FoxP3 and its negative correlation with the expression of CD127.A new approach to humanTregs was presented by Shimon Sakaguchi and his team in 2009. According to the authors, theFoxP3+ Τ cells are not a homogenous population and they can be separated in three distinctsubpopulations. Studies on the percentage and phenotypic changes of Tregs in T1D, reported a a lack in the suppressive ability of Tregs from T1D patients compared to controls. First degree relatives (FDR) of T1D patients are considered a high risk group for the disease and many studies were conducted on FDR.Objective: The aim of our study was to investigate the frequency and the phenotype of Tregs in FDR compared to healthy control, in order to investigate any possible correlation to the disease appearance.Materials and methods: 38 FDR (17 siblings, 5 children, 9 mothers and 7 fathers) and 45 healthy controls were recruited. Four colour flow cytometry was performed in whole fresh blood samples and HLA class II typing was tailored.Results: First, we tried to verify by independent means the estimated percentage of Tregs based on the phenotype CD4intCD25highCD127-/low. The percentage of Tregs was not significantly different between FDRs and controls. This was also the case, when we compared the percentages of the different subpopulations of Tregs.We found significant differences between the surface expression of several markers on Tregs compared to Teff and Tnaive. As far as the expression of different markers in FDRs compared to controls is concerned, we observed few significant differences, especially in siblings. We conducted an extended genotyping analysis of FDR concerning HLA-DR and HLA-DQ aplotypes. We also tried to determine an association between genotype and the frequency of Tregs which revealed no significant relationship. Finally, we studied the distinct characteristics of the subpopulations of Tregs based on the expression of CD2, CD4, HLA-DR, CD122, CD81, CD221. Conclusions: In this study have established a method of separating Tregs based on the use of CD127. However, the study of Tregs’ subpopulations, raises suspicion about the homogenity of the population of Tregs determined based on the classic markers CD127/ FoxP3. The frequency of Tregs in FDRs compared to controls was not significantly different, but significant differences were determined during the study of surface markers. This is more important if we take account the fact that more than half of FDRs had at least on high risk HLA-DR/DQ allele.

Περιγραφή

Λέξεις-κλειδιά

Τ ρυθμιστικά λεμφοκύτταρα, Σακχαρώδης διαβήτης τύπου 1, Υποπληθυσμοί Τ ρυθμιστικών λεμφοκυττάρων

Θεματική κατηγορία

Διαβήτης

Παραπομπή

Σύνδεσμος

Γλώσσα

el

Εκδίδον τμήμα/τομέας

Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων. Σχολή Επιστημών Υγείας. Τμήμα Ιατρικής

Όνομα επιβλέποντος

Τσατσούλης, Αγαθοκλής

Εξεταστική επιτροπή

Τσατσούλης, Αγαθοκλής
Γεωργίου, Ιωάννης
Δρόσος, Αλέξανδρος
Παπαδόπουλος, Γεώργιος
Βούλγαρη, Παρασκευή
Τζαβάρας, Θεόδωρος
Τίγκας, Στυλιανός

Γενική Περιγραφή / Σχόλια

Ίδρυμα και Σχολή/Τμήμα του υποβάλλοντος

Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων. Σχολή Επιστημών Υγείας. Τμήμα Ιατρικής

URI

https://olympias.lib.uoi.gr/jspui/handle/123456789/27797
 http://dx.doi.org/10.26268/heal.uoi.3325

Πίνακας περιεχομένων

Χορηγός

Βιβλιογραφική αναφορά

Βιβλιογράφία : σ. 179-195

Ονόματα συντελεστών

Αριθμός σελίδων

195 σ.

Λεπτομέρειες μαθήματος

Συλλογές

Διδακτορικές Διατριβές - ΙΑΤ

item.page.endorsement

item.page.review

item.page.supplemented

item.page.referenced