Regulation of aldehyde dehydrogenases by nuclear receptors CAR and PXR in rats genetically predetermined in response to phenobarbital
Φόρτωση...
Ημερομηνία
Συγγραφείς
Τουλούπη, Αικατερίνη
Touloupi, Katerina
Τίτλος Εφημερίδας
Περιοδικό ISSN
Τίτλος τόμου
Εκδότης
Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων. Σχολή Επιστημών Υγείας. Τμήμα Ιατρικής
Περίληψη
Τύπος
Είδος δημοσίευσης σε συνέδριο
Είδος περιοδικού
Είδος εκπαιδευτικού υλικού
Όνομα συνεδρίου
Όνομα περιοδικού
Όνομα βιβλίου
Σειρά βιβλίου
Έκδοση βιβλίου
Συμπληρωματικός/δευτερεύων τίτλος
Περιγραφή
The magnitude of the genes belonging to the ALDH superfamily in
organism’s welfare and especially their protection against xenobiotics, as well as the
accumulating evidence that indicate involvement of nuclear receptors in regulation
of many genes including ALDHs, has excited our interest in unraveling the potential
role of CAR and PXR in mediation/regulation of ALDH1As subfamily of genes,
utilizing the unique experimental model of Wistar/Af/Han/Mol/Kuo/Io rats.
Specifically, the two rat strains used in this study were either responsive (RR) or
non-responsive (rr) to induction of ALDH1A genes after administration of PB
(Phenobarbital) or other PB-type inducers.
The apparent difference of ALDH1As induction between the two strains,
both at basal levels and after treatment with PB or PCN, which was detected with
protein immunoprecipitation experiments, was further investigated at mRNA levels
of expression. The results revealed that the remarkable difference was attributed to
the complete absence of ALDH1A7 expression in rr strain. Furthermore, a striking
up-regulation of the gene was observed in RR rats in the presence the above drugs,
which act as selective agonists for the nuclear receptors CAR and PXR.
Concurrently, expression of ALDH1A1 gene was only slightly higher in rr rats,
compared to respective expression levels in RR animals. Supportive evidence to
our findings was displayed in experiments of ontogenesis with liver samples derived
from neonates and corresponding in vitro studies in primary hepatocyte cultures.
The nuclear translocation of CAR and PXR upon treatment with their
selective agonists was evident in both rat strains and also time- and dose-dependent,
however their potential gene activation had to be further tested by studying the
induction of their well-studied target genes; CYP2B1 and CYP3A1, respectively.
Focusing on the tremendous difference of ALDH1A7 expression between
the strains and the uncontest effect of drugs in transcription regulation, we
performed reporter gene assays with various deletion constructs of RR-ALDH1A7
and rr-ALDH1A7 promoters, as well as chromatin immunoprecipitation assays on
the same promoter regions. Interestingly, our results indicated RR-ALDH1A7 as
an active promoter highly-upregulated in response to PB administration, which is in
strong contrast to the barely active rr-ALDH1A7. Although the proximal promoter is the essential region for turning on gene transcription, we nominated a region of
the RR-ALDH1A7 promoter between -1566 to -452,which demonstrated highest
activation potential.
CAR was emerged as a substantial regulator of RR-ALDH1A7 gene
activation, especially when PB or other CAR-activators were administered. In RRALDH1A7,
CAR was found to bind to the distal promoter of the gene, serving as
enhancer of gene expression, and presumably PXR may also be able to bind, since
the receptors are promiscuous to their binding to targets and cross-talk to each other.
H σπουδαιότητα των ενζύμων που ανήκουν στην υπερ-οικογένεια των αλδεϋδικών αφυδρογονασών (ALDHs) στην ευζωία των οργανισμών και κυρίως στην προστασία τους από ξενοβιοτικούς παράγοντες, καθώς και η συσσώρευση στοιχείων που υποδηλώνουν την εμπλοκή πυρηνικών υποδοχέων στην ρύθμιση της έκφρασης πολλών γονιδίων, συμπεριλαμβανομένων των αλδεϋδικών αφυδρογονασών, κέντρισε το ενδιαφέρον μας να αποκαλύψουμε τον πιθανό ρόλο των υποδοχέων CAR και PXR στην επαγωγή/ρύθμιση των ALDHs της υπο- οικογένειας 1Α, αξιοποιώντας το ιδιαίτερο πειραματικό μοντέλο των επίμυων του γένους Wistar/Af/Han/Mol/Kuo/Io. Συγκεκριμένα, τα δυο στελέχη των επίμυων που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα μελέτη χαρακτηρίζονται ως αποκρινόμενα (RR) ή μη-αποκρινόμενα (rr) ως προς την επαγωγή των γονιδίων ALDH1A, μετά την χορήγηση φαινοβαρβιτάλης (ΡΒ) ή άλλων ΡΒ τύπου επαγωγέων. H προφανής διαφορά στην επαγωγή των ALDH1As μεταξύ των δύο στελεχών, που ανιχνεύτηκε με πειράματα μελέτης των πρωτεϊνών, τόσο σε βασικά επίπεδα έκφρασης όσο και μετά τη χορήγηση φαινοβαρβιτάλης (PB) ή καρβονιτριλίου της πρεγνενολόνης (PCN), διερευνήθηκε περαιτέρω με μελέτη των επιπέδων παραγωγής mRNA. Τα αποτελέσματα αποκάλυψαν ότι η αξιοσημείωτη διαφορά οφείλεται στην παντελή έλλειψη έκφρασης του γονιδίου ALDH1A7 στο στέλεχος rr. Επίσης, παρατηρήθηκε εντυπωσιακή αυξο-ρύθμιση στους RR επίμυες, ιδιαίτερα παρουσία των παραπάνω φαρμάκων, τα οποία δρουν ως εκλεκτικοί αγωνιστές των πυρηνικών υποδοχέων CAR και PXR. Παράλληλα, η έκφραση του γονιδίου ALDH1A1 βρέθηκε λίγο υψηλότερη στους rr επίμυες, συγκριτικά με τα αντίστοιχα επίπεδα στο RR στέλεχος. Αποτελέσματα που υποστηρίζουν τα παραπάνω στοιχεία προέκυψαν και από πειράματα οντογένεσης που πραγματοποιήθηκαν σε ήπαρ από νεογέννητους επίμυες, αλλά και σε αντίστοιχη in vitro μελέτη πρωτογενών καλλιεργειών ηπατοκυττάρων. Η μετακίνηση των υποδοχέων CAR και PXR στον πυρήνα των κυττάρων, μετά την χορήγηση των εκλεκτικών αγωνιστών τους ήταν εμφανής και στα δύο στελέχη των επίμυων, και επίσης ήταν χρονο- και δόσο-εξαρτώμενη. Ωστόσο, η ικανότητά τους να ενεργοποιούν την έκφραση γονιδίων μελετήθηκε περαιτέρω, με μέτρηση της επαγωγής γνωστών γονιδίων στόχων τους: των κυτοχρωμάτων CYP2B1 και CYP3A1, αντίστοιχα. Εστιάζοντας στην σημαντικά υψηλή διαφορά μεταξύ των δύο στελεχών ως προς την έκφραση της ALDH1A7 και την αδιαμφισβήτητη επίδραση των παραπάνω φαρμάκων στην ρύθμιση της έκφρασης, πραγματοποιήσαμε δοκιμασίες μέτρησης γονιδίου αναφοράς, χρησιμοποιώντας διάφορα τμήματα των υποκινητών του γονιδίου, προερχόμενα από τα δύο στελέχη (RR-ALDH1A7 και rr- ALDH1A7). Επιπλέον, πραγματοποιήθηκαν δοκιμασίες ανοσοκαθίζησης της χρωματίνης στα παραπάνω τμήματα των υποκινητών. Ιδιαίτερα ενδιαφέρον ήταν το εύρημα ότι ο υποκινητής RR-ALDH1A7 είναι ενεργός και μάλιστα η ενεργότητά του αυξάνεται δραστικά σε περίπτωση χορήγησης ΡΒ, γεγονός το οποίο είναι σε πλήρη αντίθεση με την ελάχιστη ενεργότητα που επέδειξε ο υποκινητής rr- ALDH1A7. Παρ’ όλο που ο η περιοχή του υποκινητή που βρίσκεται κοντά στην αρχή του γονιδίου είναι η πιο σημαντική για την ενεργοποίηση της έκφρασης, βρέθηκε ότι η περιοχή του υποκινητή RR-ALDH1A7 που βρίσκεται μεταξύ -1566 και -452 είναι υπεύθυνη για την μέγιστη ενεργότητα. O πυρηνικός υποδοχέας CAR αναδεικνύεται ως κύριος ρυθμιστής της έκφρασης του γονιδίου RR-ALDH1A7, ιδιαίτερα μετά την χορήγηση PB ή άλλων αγωνιστών του CAR. Ειδικότερα στο γονίδιο RR-ALDH1A7 ο CAR βρέθηκε ότι προσδένενται στον υποκινητή μακριά από την θέση έναρξης της μεταγραφής, δρώντας κυρίως ως ενισχυτής της έκφρασης του γονιδίου, και πιθανότατα και ο PXR να δύναται να προσδεθεί, δεδομένου ότι οι δύο υποδοχείς συχνά ανταλλάσουν τις θέσεις πρόσδεσής τους στα γονίδια-στόχους και αλληλεπιδρούν μεταξύ τους.
H σπουδαιότητα των ενζύμων που ανήκουν στην υπερ-οικογένεια των αλδεϋδικών αφυδρογονασών (ALDHs) στην ευζωία των οργανισμών και κυρίως στην προστασία τους από ξενοβιοτικούς παράγοντες, καθώς και η συσσώρευση στοιχείων που υποδηλώνουν την εμπλοκή πυρηνικών υποδοχέων στην ρύθμιση της έκφρασης πολλών γονιδίων, συμπεριλαμβανομένων των αλδεϋδικών αφυδρογονασών, κέντρισε το ενδιαφέρον μας να αποκαλύψουμε τον πιθανό ρόλο των υποδοχέων CAR και PXR στην επαγωγή/ρύθμιση των ALDHs της υπο- οικογένειας 1Α, αξιοποιώντας το ιδιαίτερο πειραματικό μοντέλο των επίμυων του γένους Wistar/Af/Han/Mol/Kuo/Io. Συγκεκριμένα, τα δυο στελέχη των επίμυων που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα μελέτη χαρακτηρίζονται ως αποκρινόμενα (RR) ή μη-αποκρινόμενα (rr) ως προς την επαγωγή των γονιδίων ALDH1A, μετά την χορήγηση φαινοβαρβιτάλης (ΡΒ) ή άλλων ΡΒ τύπου επαγωγέων. H προφανής διαφορά στην επαγωγή των ALDH1As μεταξύ των δύο στελεχών, που ανιχνεύτηκε με πειράματα μελέτης των πρωτεϊνών, τόσο σε βασικά επίπεδα έκφρασης όσο και μετά τη χορήγηση φαινοβαρβιτάλης (PB) ή καρβονιτριλίου της πρεγνενολόνης (PCN), διερευνήθηκε περαιτέρω με μελέτη των επιπέδων παραγωγής mRNA. Τα αποτελέσματα αποκάλυψαν ότι η αξιοσημείωτη διαφορά οφείλεται στην παντελή έλλειψη έκφρασης του γονιδίου ALDH1A7 στο στέλεχος rr. Επίσης, παρατηρήθηκε εντυπωσιακή αυξο-ρύθμιση στους RR επίμυες, ιδιαίτερα παρουσία των παραπάνω φαρμάκων, τα οποία δρουν ως εκλεκτικοί αγωνιστές των πυρηνικών υποδοχέων CAR και PXR. Παράλληλα, η έκφραση του γονιδίου ALDH1A1 βρέθηκε λίγο υψηλότερη στους rr επίμυες, συγκριτικά με τα αντίστοιχα επίπεδα στο RR στέλεχος. Αποτελέσματα που υποστηρίζουν τα παραπάνω στοιχεία προέκυψαν και από πειράματα οντογένεσης που πραγματοποιήθηκαν σε ήπαρ από νεογέννητους επίμυες, αλλά και σε αντίστοιχη in vitro μελέτη πρωτογενών καλλιεργειών ηπατοκυττάρων. Η μετακίνηση των υποδοχέων CAR και PXR στον πυρήνα των κυττάρων, μετά την χορήγηση των εκλεκτικών αγωνιστών τους ήταν εμφανής και στα δύο στελέχη των επίμυων, και επίσης ήταν χρονο- και δόσο-εξαρτώμενη. Ωστόσο, η ικανότητά τους να ενεργοποιούν την έκφραση γονιδίων μελετήθηκε περαιτέρω, με μέτρηση της επαγωγής γνωστών γονιδίων στόχων τους: των κυτοχρωμάτων CYP2B1 και CYP3A1, αντίστοιχα. Εστιάζοντας στην σημαντικά υψηλή διαφορά μεταξύ των δύο στελεχών ως προς την έκφραση της ALDH1A7 και την αδιαμφισβήτητη επίδραση των παραπάνω φαρμάκων στην ρύθμιση της έκφρασης, πραγματοποιήσαμε δοκιμασίες μέτρησης γονιδίου αναφοράς, χρησιμοποιώντας διάφορα τμήματα των υποκινητών του γονιδίου, προερχόμενα από τα δύο στελέχη (RR-ALDH1A7 και rr- ALDH1A7). Επιπλέον, πραγματοποιήθηκαν δοκιμασίες ανοσοκαθίζησης της χρωματίνης στα παραπάνω τμήματα των υποκινητών. Ιδιαίτερα ενδιαφέρον ήταν το εύρημα ότι ο υποκινητής RR-ALDH1A7 είναι ενεργός και μάλιστα η ενεργότητά του αυξάνεται δραστικά σε περίπτωση χορήγησης ΡΒ, γεγονός το οποίο είναι σε πλήρη αντίθεση με την ελάχιστη ενεργότητα που επέδειξε ο υποκινητής rr- ALDH1A7. Παρ’ όλο που ο η περιοχή του υποκινητή που βρίσκεται κοντά στην αρχή του γονιδίου είναι η πιο σημαντική για την ενεργοποίηση της έκφρασης, βρέθηκε ότι η περιοχή του υποκινητή RR-ALDH1A7 που βρίσκεται μεταξύ -1566 και -452 είναι υπεύθυνη για την μέγιστη ενεργότητα. O πυρηνικός υποδοχέας CAR αναδεικνύεται ως κύριος ρυθμιστής της έκφρασης του γονιδίου RR-ALDH1A7, ιδιαίτερα μετά την χορήγηση PB ή άλλων αγωνιστών του CAR. Ειδικότερα στο γονίδιο RR-ALDH1A7 ο CAR βρέθηκε ότι προσδένενται στον υποκινητή μακριά από την θέση έναρξης της μεταγραφής, δρώντας κυρίως ως ενισχυτής της έκφρασης του γονιδίου, και πιθανότατα και ο PXR να δύναται να προσδεθεί, δεδομένου ότι οι δύο υποδοχείς συχνά ανταλλάσουν τις θέσεις πρόσδεσής τους στα γονίδια-στόχους και αλληλεπιδρούν μεταξύ τους.
Περιγραφή
Λέξεις-κλειδιά
ALDHs, Ένζυμα, Φαινοβαρβιτάλη
Θεματική κατηγορία
Aldehyde dehydrogenase
Παραπομπή
Σύνδεσμος
Γλώσσα
en
Εκδίδον τμήμα/τομέας
Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων. Σχολή Επιστημών Υγείας. Τμήμα Ιατρικής
Όνομα επιβλέποντος
Παππάς, Περικλής
Εξεταστική επιτροπή
Paavo, Honkakoski
Μαρσέλος, Μάριος-Αθανάσιος
Αγγελίδης, Χαράλαμπος
Κωνσταντή, Μαρία
Φριλίγγος, Ευστάθιος
Παππάς, Περικλής
Λεονταρίτης, Γεώργιος
Μαρσέλος, Μάριος-Αθανάσιος
Αγγελίδης, Χαράλαμπος
Κωνσταντή, Μαρία
Φριλίγγος, Ευστάθιος
Παππάς, Περικλής
Λεονταρίτης, Γεώργιος
Γενική Περιγραφή / Σχόλια
Ίδρυμα και Σχολή/Τμήμα του υποβάλλοντος
Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων. Σχολή Επιστημών Υγείας. Τμήμα Ιατρικής
Πίνακας περιεχομένων
Χορηγός
Βιβλιογραφική αναφορά
Βιβλιογραφία : σ. 114-128
Ονόματα συντελεστών
Αριθμός σελίδων
128 σ.