Κλωνοποίηση, υπερέκφραση και χαρακτηρισμός της 1,2- διοξυγονάσης του γεντισικού οξέος από το Pseudarthrobacter phenanthrenivorans Sphe3
Φόρτωση...
Ημερομηνία
Συγγραφείς
Λάππα, Ειρήνη
Τίτλος Εφημερίδας
Περιοδικό ISSN
Τίτλος τόμου
Εκδότης
Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων. Σχολή Επιστημών Υγείας. Τμήμα Ιατρικής
Περίληψη
Τύπος
Είδος δημοσίευσης σε συνέδριο
Είδος περιοδικού
Είδος εκπαιδευτικού υλικού
Όνομα συνεδρίου
Όνομα περιοδικού
Όνομα βιβλίου
Σειρά βιβλίου
Έκδοση βιβλίου
Συμπληρωματικός/δευτερεύων τίτλος
Περιγραφή
Οι πολυκυκλικοί αρωματικοί υδρογονάνθρακες είναι μια μεγάλη ομάδα χημι-κών ουσιών με δύο ή περισσότερους αρωματικούς δακτυλίους. Οι φυσικοχημικές τους ιδιότητες έχουν επιπτώσεις τόσο στον άνθρωπο, όσο και στο περιβάλλον. Για το λόγο αυτό όλο και πιο έντονο γίνεται το ενδιαφέρον της επιστημονικής κοινότητας για τη διερεύνηση των μεθόδων αποδόμησης των ουσιών αυτών. Το βακτήριο Pseudarthrobacter phenanthrenivorans Sphe3 απομονώθηκε από μία περιοχή της Ηπείρου, που είναι μολυσμένη από το κρεόζωτο. Είναι ικανό να με-ταβολίζει τους πολυκυκλικούς αρωματικούς υδρογονάνθρακες, όπως το φαινανθρέ-νιο. Το γεντισικό οξύ αποτελεί ενδιάμεσο μεταβολίτη, κλειδί στην αερόβια βακτηρια-κή αποδόμηση αρωματικών ενώσεων. Στην παρούσα εργασία, ένα γονίδιο μήκους 1112 bp, που κωδικοποιεί την 1,2-διοξυγονάση του γεντισικού οξέος κλωνοποιήθηκε στον πλασμιδιακό φορέα pET29c και υπερεκφράστηκε στα βακτηριακά κύτταρα Escherichia coli BL21. Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε καθαρισμός του ενζύμου με στήλη αγχιστείας Ni2+-NTA και με-λετήθηκαν τα βιοχημικά του χαρακτηριστικά. Η 1,2-διοξυγονάση του γεντισικού οξέ-ος ακολουθεί κινητική Michaelis-Menten. Οι τιμές Km και kcat/Km για το γεντισικό ο-ξύ είναι 24.9 μΜ και 28.75 s-1 M-1 103, αντίστοιχα. Η δραστικότητα του ενζύμου είναι βέλτιστη στους 50οC και σε εύρος τιμών pH 7.5-8. Η δραστικότητα αυξάνεται μετά από επώαση του ενζύμου σε 0.2 mM Fe2+/L-ascorbate για 30 min. H o-φαινανθρολί-νη παρουσιάζει ισχυρή ανασταλτική δράση, καθώς επίσης και τα ιόντα Cu2+, Ni2+ σε μικρότερο βαθμό.
Polycyclic aromatic hydrocarbons are a large group of chemicals with two or more aromatic rings. Their physicochemical properties affect both humans and the environment. This is why the scientific community is increasingly interested in exploring the methods of degradation of these substances. The bacterium Pseudarthrobacter phenanthrenivorans Sphe3 was isolated from a region of Epirus contaminated with creosote. It is capable of degrading polycyclic aromatic hydrocarbons, such as phenanthrene. Gentisic acid is an intermediate metabolite, key in the aerobic bacterial degradation of aromatic compounds. In the present study, an 1112 bp gene encoding gentisate dioxygenase was cloned into the plasmid vector pET29c and overexpressed in Escherichia coli BL21 bacterial cells. Thereafter, the enzyme was purified by Ni2+-NTA affinity column and its biochemical characteristics were studied. Gentisate dioxoxygenase follows Michaelis-Menten kinetics. The values of Km and kcat/Km for gentisic acid are 24.9 μM and 28.75 s-1 M-1 103, respectively. The activity of the enzyme is optimal at 50°C and pH 7.5-8. The activity is increased after incubation of the enzyme in 0.2 mM Fe2+/L-ascorbate for 30 min. O-phenanthroline has a strong inhibitory effect, as well as Cu2+, Ni2+ to a lesser influence.
Polycyclic aromatic hydrocarbons are a large group of chemicals with two or more aromatic rings. Their physicochemical properties affect both humans and the environment. This is why the scientific community is increasingly interested in exploring the methods of degradation of these substances. The bacterium Pseudarthrobacter phenanthrenivorans Sphe3 was isolated from a region of Epirus contaminated with creosote. It is capable of degrading polycyclic aromatic hydrocarbons, such as phenanthrene. Gentisic acid is an intermediate metabolite, key in the aerobic bacterial degradation of aromatic compounds. In the present study, an 1112 bp gene encoding gentisate dioxygenase was cloned into the plasmid vector pET29c and overexpressed in Escherichia coli BL21 bacterial cells. Thereafter, the enzyme was purified by Ni2+-NTA affinity column and its biochemical characteristics were studied. Gentisate dioxoxygenase follows Michaelis-Menten kinetics. The values of Km and kcat/Km for gentisic acid are 24.9 μM and 28.75 s-1 M-1 103, respectively. The activity of the enzyme is optimal at 50°C and pH 7.5-8. The activity is increased after incubation of the enzyme in 0.2 mM Fe2+/L-ascorbate for 30 min. O-phenanthroline has a strong inhibitory effect, as well as Cu2+, Ni2+ to a lesser influence.
Περιγραφή
Λέξεις-κλειδιά
Πολυκυκλικοί αρωματικοί υδρογονάνθρακες, Βιοαποδόμηση, Βακτήρια, Γενετικό οξύ, Polycyclic aromatic hydrocarbons, Biodegradation, Bacteria, Gentisic acid
Θεματική κατηγορία
Υδρογονάνθρακες
Παραπομπή
Σύνδεσμος
Γλώσσα
el
Εκδίδον τμήμα/τομέας
Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων. Σχολή Επιστημών Υγείας. Τμήμα Ιατρικής
Όνομα επιβλέποντος
Κούκκου, Άννα-Ειρήνη
Εξεταστική επιτροπή
Κούκκου, Άννα-Ειρήνη
Χατζηλουκάς, Ευστάθιος
Αφένδρα, Αμαλία
Χατζηλουκάς, Ευστάθιος
Αφένδρα, Αμαλία
Γενική Περιγραφή / Σχόλια
Ίδρυμα και Σχολή/Τμήμα του υποβάλλοντος
Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων. Σχολή Επιστημών Υγείας. Τμήμα Ιατρικής
Πίνακας περιεχομένων
Χορηγός
Βιβλιογραφική αναφορά
Βιβλιογραφία: σ. 100-111
Ονόματα συντελεστών
Αριθμός σελίδων
111 σ.