Χημειοεκλεκτικός εμπλουτισμός και ταυτοποίηση ενδογενώς S-νιτροζυλιωμένων πρωτεϊνών στον καρδιακό μυ
Φόρτωση...
Ημερομηνία
Συγγραφείς
Συμεωνίδου, Μαρία
Symeonidou, Maria
Τίτλος Εφημερίδας
Περιοδικό ISSN
Τίτλος τόμου
Εκδότης
Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων. Σχολή Επιστημών Υγείας. Τμήμα Ιατρικής
Περίληψη
Τύπος
Είδος δημοσίευσης σε συνέδριο
Είδος περιοδικού
Είδος εκπαιδευτικού υλικού
Όνομα συνεδρίου
Όνομα περιοδικού
Όνομα βιβλίου
Σειρά βιβλίου
Έκδοση βιβλίου
Συμπληρωματικός/δευτερεύων τίτλος
Περιγραφή
Tο Βραβείο Νόμπελ Φυσιολογίας ή Ιατρικής για το έτος 1998 απονεμήθηκε για
την ανακάλυψη του μονοξειδίου του αζώτου (NO) ως μορίου σηματοδότησης στο
καρδιαγγειακό σύστημα. Η σηματοδοτική δράση του NO επιτυγχάνεται μέσω της
φωσφορυλίωσης που προκαλείται από το cGMP που παράγει η sGC ή/και της S νιτροζυλίωσης. Η παρούσα μελέτη έχει δύο στόχους. Ο πρώτος στόχος είναι η
αξιολόγηση της εκλεκτικότητας, ευαισθησίας και επαναληψιμότητας μιας μεθόδου
χημικού εμπλουτισμού S-νιτροζυλιωμένων πρωτεϊνών και πεπτιδιών. Ο εμπλουτισμός
επιτυγχάνεται με την αντίδραση οργανικού υδραργύρου με S-νιτροοκυστεΐνη σε
pH=6.0. Ο υδράργυρος ακινητοποιείται σε σφαιρίδια αγαρόζης σχηματίζοντας ρητίνη
που τοποθετείται σε κολώνες χρωματογραφίας διευκολύνοντας το χειρισμό του
δείγματος. Με συνδυαστική χρήση καθαρής πρωτεϊνης και βιολογικών δειγμάτων
αποδείχθηκε ότι η χημική αντίδραση του οργανικού υδράργυρου είναι επιλεκτική για
την S-νιτροσοκυστεΐνη καθώς δεν διαπιστώθηκε αντίδραση με άλλες οξειδωτικές
τροποποιήσεις της κυστεϊνης. Επιπλέον, χρησιμοποιώντας χημικά και βιολογικά θετικά
και αρνητικά δείγματα δείχθηκε ότι η αντίδραση του οργανικού υδραργύρου με την S νιτροκυστεΐνη είναι ιδιαίτερα ευαίσθητη επιτρέποντας τον χημικό εμπλουτισμό
ενδογενους S-νιτροζυλίωσης.
Ο δεύτερος στόχος της μελέτης ήταν η χρήση του χημειεκλεκτικού
εμπλουτισμού για την ταυτοποίηση θέσεων ενδογενούς S-νιτροζυλίωσης στο καρδιακό
μυ με χρήση φασματομετρίας μάζας. Χρησιμοποιώντας δείγματα από ποντίκια άγριου
τύπου, nNOS-/-
, iNOS-/-
και tNOS-/-
παρατηρήθηκε σημαντική μείωση των θέσεων S νιτροζυλίωσης στην καρδιά των ποντικών tNOS-/- αποδεικνύοντας την εξάρτηση της
S-νιτροζυλίωσης από το ΝΟ που παράγεται ενζυμικά. Επιπλέον, συνδυάζοντας τον
χημειοεκλεκτικό εμπλουτισμό με την ανοσοαποτύπωση κατά Western εξετάστηκε η
ενδογενής S-νιτροσυλίωσης των ενζύμων του μονοπατιού της β-οξείδωσης και η
εξάρτηση της από τις συνθάσες του ΝΟ. Δείχθηκε ότι η ενδογενής S-νιτροζυλίωση
των ενζύμων CPT2, VLCAD και TFP-b εξαρτάται από ΝΟ που παράγεται από την
eNOS.
Εν κατακλείδι, η παρούσα μελέτη αποδεικνύει ότι ο χημικός εμπλουτισμός S νιτροζυλιωμένων πρωτεϊνών και πεπτιδίων με τη χρήση φαινυλοϋδραργύρου είναι
χημειοεκλεκτικός και παρέχει την απαιτούμενη ευαισθησία για την ανίχνευση
7
ενδογενούς S-νιτροζυλίωσης. O συνδυασμός του με υψηλής ευκρίνειας
φασματομετρία μάζας ή αναλυτικές τεχνικές επιτρέπει την διερεύνυση του ρόλου της
S-νιτροζυλίωσης σε βιολογικά συστήματα.
The discovery of nitric oxide (NO) as a signaling molecule in the cardiovascular system was awarded the Nobel Prize in Physiology or Medicine in 1998. Signaling functions of NO are achieved through sGC-cGMP-dependent phosphorylation as well as through the selective and reversible modification of protein cysteine residues, namely S-nitrosylation. The current study has two objectives. The first is to assess the selectivity, sensitivity, and reproducibility of a strategy chemically enriching S-nitrosylated proteins and peptides. This enrichment is achieved through the reaction of organic mercury with S-nitrosocysteine at pH 6.0. The mercury is immobilized on agarose beads forming a resin that is placed in chromatography columns to facilitate sample handling. Using pure protein and biological samples we demonstrated that the organic mercury's chemical reaction is selective for S-nitrosocysteine, as it does not react with other oxidative modifications of cysteine. Additionally, using both positive and negative chemical and biological samples, it was demonstrated that the reaction with S-nitrosocysteine is highly sensitive, enabling the chemical enrichment of endogenous S-nitrosylation. The second objective is to employ this chemo-selective enrichment for identifying sites of endogenous S-nitrosylation in cardiac muscle via mass spectrometry. Mass-spectrometry-based identification of S-nitrosylation sites in wild type, nNOS-/- , iNOS-/- , and tNOS-/- mice revealed a notable decrease in S-nitrosylation sites in the hearts of tNOS-/- mice, indicating the reliance of endogenous S-nitrosylation on enzyme-derived NO. Moreover, we employed chemical enrichment and Western blot analysis to investigate the S-nitrosylation of enzymes participating in β-oxidation pathway as well as the dependency of modification from NOS. It was documented that CPT2, VLCAD, and TFP-b are endogenously S-nitrosylated in the heart through mechanisms that require eNOS-derived NO. In summary, this study documents that the chemical enrichment of S nitrosylated proteins and peptides using phenylmercury is selective and sensitive 8 enough for detecting endogenous S-nitrosylation. In conjunction with high-resolution mass spectrometry or other analytical techniques it enables the exploration of the role of S-nitrosylation in biological systems.
The discovery of nitric oxide (NO) as a signaling molecule in the cardiovascular system was awarded the Nobel Prize in Physiology or Medicine in 1998. Signaling functions of NO are achieved through sGC-cGMP-dependent phosphorylation as well as through the selective and reversible modification of protein cysteine residues, namely S-nitrosylation. The current study has two objectives. The first is to assess the selectivity, sensitivity, and reproducibility of a strategy chemically enriching S-nitrosylated proteins and peptides. This enrichment is achieved through the reaction of organic mercury with S-nitrosocysteine at pH 6.0. The mercury is immobilized on agarose beads forming a resin that is placed in chromatography columns to facilitate sample handling. Using pure protein and biological samples we demonstrated that the organic mercury's chemical reaction is selective for S-nitrosocysteine, as it does not react with other oxidative modifications of cysteine. Additionally, using both positive and negative chemical and biological samples, it was demonstrated that the reaction with S-nitrosocysteine is highly sensitive, enabling the chemical enrichment of endogenous S-nitrosylation. The second objective is to employ this chemo-selective enrichment for identifying sites of endogenous S-nitrosylation in cardiac muscle via mass spectrometry. Mass-spectrometry-based identification of S-nitrosylation sites in wild type, nNOS-/- , iNOS-/- , and tNOS-/- mice revealed a notable decrease in S-nitrosylation sites in the hearts of tNOS-/- mice, indicating the reliance of endogenous S-nitrosylation on enzyme-derived NO. Moreover, we employed chemical enrichment and Western blot analysis to investigate the S-nitrosylation of enzymes participating in β-oxidation pathway as well as the dependency of modification from NOS. It was documented that CPT2, VLCAD, and TFP-b are endogenously S-nitrosylated in the heart through mechanisms that require eNOS-derived NO. In summary, this study documents that the chemical enrichment of S nitrosylated proteins and peptides using phenylmercury is selective and sensitive 8 enough for detecting endogenous S-nitrosylation. In conjunction with high-resolution mass spectrometry or other analytical techniques it enables the exploration of the role of S-nitrosylation in biological systems.
Περιγραφή
Λέξεις-κλειδιά
Σηματοδότηση ΝΟ, Nitric oxide signaling, S-nitrosylation, S-νιτροζυλίωση
Θεματική κατηγορία
Μονοξειδιο του Αζώτου (ΝΟ)
Παραπομπή
Σύνδεσμος
Γλώσσα
el
Εκδίδον τμήμα/τομέας
Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων. Σχολή Επιστημών Υγείας. Τμήμα Ιατρικής
Όνομα επιβλέποντος
Δούλιας, Πασχάλης-Θωμάς
Εξεταστική επιτροπή
Λιακόπουλος, Δημήτριος
Μπέης, Δημήτριος
Φριλίγγος, Ευστάθιος
Χριστοφίδης, Δημήτριος
Μπέης, Δημήτριος
Φριλίγγος, Ευστάθιος
Χριστοφίδης, Δημήτριος
Γενική Περιγραφή / Σχόλια
Ίδρυμα και Σχολή/Τμήμα του υποβάλλοντος
Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων. Σχολή Επιστημών Υγείας
University of Ioannina. School of Health Sciences
University of Ioannina. School of Health Sciences
Πίνακας περιεχομένων
Χορηγός
Βιβλιογραφική αναφορά
Ονόματα συντελεστών
Αριθμός σελίδων
64
Λεπτομέρειες μαθήματος
item.page.endorsement
item.page.review
item.page.supplemented
item.page.referenced
Άδεια Creative Commons
Άδεια χρήσης της εγγραφής: Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 United States