Χημειοεκλεκτικός εμπλουτισμός και ταυτοποίηση ενδογενώς S-νιτροζυλιωμένων πρωτεϊνών στον καρδιακό μυ

Απλή σελίδα τεκμηρίου
dc.contributor.authorΣυμεωνίδου, Μαρίαel
dc.contributor.authorSymeonidou, Mariaen
dc.date.accessioned2024-10-29T14:49:35Z
dc.date.available2024-10-29T14:49:35Z
dc.identifier.urihttps://olympias.lib.uoi.gr/jspui/handle/123456789/38490
dc.identifier.urihttp://dx.doi.org/10.26268/heal.uoi.18195
dc.rightsAttribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 United States*
dc.rights.urihttp://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/us/*
dc.subjectΣηματοδότηση ΝΟel
dc.subjectNitric oxide signalingen
dc.subjectS-nitrosylationen
dc.subjectS-νιτροζυλίωσηel
dc.titleΧημειοεκλεκτικός εμπλουτισμός και ταυτοποίηση ενδογενώς S-νιτροζυλιωμένων πρωτεϊνών στον καρδιακό μυel
dc.titleChemoselective enrichment and identification of endogenously S-nitrosylated proteins in cardiac muscleen
dc.typemasterThesisen
heal.abstractTο Βραβείο Νόμπελ Φυσιολογίας ή Ιατρικής για το έτος 1998 απονεμήθηκε για την ανακάλυψη του μονοξειδίου του αζώτου (NO) ως μορίου σηματοδότησης στο καρδιαγγειακό σύστημα. Η σηματοδοτική δράση του NO επιτυγχάνεται μέσω της φωσφορυλίωσης που προκαλείται από το cGMP που παράγει η sGC ή/και της S νιτροζυλίωσης. Η παρούσα μελέτη έχει δύο στόχους. Ο πρώτος στόχος είναι η αξιολόγηση της εκλεκτικότητας, ευαισθησίας και επαναληψιμότητας μιας μεθόδου χημικού εμπλουτισμού S-νιτροζυλιωμένων πρωτεϊνών και πεπτιδιών. Ο εμπλουτισμός επιτυγχάνεται με την αντίδραση οργανικού υδραργύρου με S-νιτροοκυστεΐνη σε pH=6.0. Ο υδράργυρος ακινητοποιείται σε σφαιρίδια αγαρόζης σχηματίζοντας ρητίνη που τοποθετείται σε κολώνες χρωματογραφίας διευκολύνοντας το χειρισμό του δείγματος. Με συνδυαστική χρήση καθαρής πρωτεϊνης και βιολογικών δειγμάτων αποδείχθηκε ότι η χημική αντίδραση του οργανικού υδράργυρου είναι επιλεκτική για την S-νιτροσοκυστεΐνη καθώς δεν διαπιστώθηκε αντίδραση με άλλες οξειδωτικές τροποποιήσεις της κυστεϊνης. Επιπλέον, χρησιμοποιώντας χημικά και βιολογικά θετικά και αρνητικά δείγματα δείχθηκε ότι η αντίδραση του οργανικού υδραργύρου με την S νιτροκυστεΐνη είναι ιδιαίτερα ευαίσθητη επιτρέποντας τον χημικό εμπλουτισμό ενδογενους S-νιτροζυλίωσης. Ο δεύτερος στόχος της μελέτης ήταν η χρήση του χημειεκλεκτικού εμπλουτισμού για την ταυτοποίηση θέσεων ενδογενούς S-νιτροζυλίωσης στο καρδιακό μυ με χρήση φασματομετρίας μάζας. Χρησιμοποιώντας δείγματα από ποντίκια άγριου τύπου, nNOS-/- , iNOS-/- και tNOS-/- παρατηρήθηκε σημαντική μείωση των θέσεων S νιτροζυλίωσης στην καρδιά των ποντικών tNOS-/- αποδεικνύοντας την εξάρτηση της S-νιτροζυλίωσης από το ΝΟ που παράγεται ενζυμικά. Επιπλέον, συνδυάζοντας τον χημειοεκλεκτικό εμπλουτισμό με την ανοσοαποτύπωση κατά Western εξετάστηκε η ενδογενής S-νιτροσυλίωσης των ενζύμων του μονοπατιού της β-οξείδωσης και η εξάρτηση της από τις συνθάσες του ΝΟ. Δείχθηκε ότι η ενδογενής S-νιτροζυλίωση των ενζύμων CPT2, VLCAD και TFP-b εξαρτάται από ΝΟ που παράγεται από την eNOS. Εν κατακλείδι, η παρούσα μελέτη αποδεικνύει ότι ο χημικός εμπλουτισμός S νιτροζυλιωμένων πρωτεϊνών και πεπτιδίων με τη χρήση φαινυλοϋδραργύρου είναι χημειοεκλεκτικός και παρέχει την απαιτούμενη ευαισθησία για την ανίχνευση 7 ενδογενούς S-νιτροζυλίωσης. O συνδυασμός του με υψηλής ευκρίνειας φασματομετρία μάζας ή αναλυτικές τεχνικές επιτρέπει την διερεύνυση του ρόλου της S-νιτροζυλίωσης σε βιολογικά συστήματα.el
heal.abstractThe discovery of nitric oxide (NO) as a signaling molecule in the cardiovascular system was awarded the Nobel Prize in Physiology or Medicine in 1998. Signaling functions of NO are achieved through sGC-cGMP-dependent phosphorylation as well as through the selective and reversible modification of protein cysteine residues, namely S-nitrosylation. The current study has two objectives. The first is to assess the selectivity, sensitivity, and reproducibility of a strategy chemically enriching S-nitrosylated proteins and peptides. This enrichment is achieved through the reaction of organic mercury with S-nitrosocysteine at pH 6.0. The mercury is immobilized on agarose beads forming a resin that is placed in chromatography columns to facilitate sample handling. Using pure protein and biological samples we demonstrated that the organic mercury's chemical reaction is selective for S-nitrosocysteine, as it does not react with other oxidative modifications of cysteine. Additionally, using both positive and negative chemical and biological samples, it was demonstrated that the reaction with S-nitrosocysteine is highly sensitive, enabling the chemical enrichment of endogenous S-nitrosylation. The second objective is to employ this chemo-selective enrichment for identifying sites of endogenous S-nitrosylation in cardiac muscle via mass spectrometry. Mass-spectrometry-based identification of S-nitrosylation sites in wild type, nNOS-/- , iNOS-/- , and tNOS-/- mice revealed a notable decrease in S-nitrosylation sites in the hearts of tNOS-/- mice, indicating the reliance of endogenous S-nitrosylation on enzyme-derived NO. Moreover, we employed chemical enrichment and Western blot analysis to investigate the S-nitrosylation of enzymes participating in β-oxidation pathway as well as the dependency of modification from NOS. It was documented that CPT2, VLCAD, and TFP-b are endogenously S-nitrosylated in the heart through mechanisms that require eNOS-derived NO. In summary, this study documents that the chemical enrichment of S nitrosylated proteins and peptides using phenylmercury is selective and sensitive 8 enough for detecting endogenous S-nitrosylation. In conjunction with high-resolution mass spectrometry or other analytical techniques it enables the exploration of the role of S-nitrosylation in biological systems.en
heal.academicPublisherΠανεπιστήμιο Ιωαννίνων. Σχολή Επιστημών Υγείας. Τμήμα Ιατρικήςel
heal.academicPublisherIDuoiel
heal.accessfreeel
heal.advisorNameΔούλιας, Πασχάλης-Θωμάςel
heal.classificationΜονοξειδιο του Αζώτου (ΝΟ)el
heal.committeeMemberNameΛιακόπουλος, Δημήτριοςel
heal.committeeMemberNameΜπέης, Δημήτριοςel
heal.committeeMemberNameΦριλίγγος, Ευστάθιοςel
heal.committeeMemberNameΧριστοφίδης, Δημήτριοςel
heal.dateAvailable2024-10-29T14:50:36Z
heal.fullTextAvailabilitytrue
heal.fullTextAvailabilitytrue
heal.fullTextAvailabilitytrue
heal.fullTextAvailabilitytrue
heal.languageelel
heal.numberOfPages64el
heal.publicationDate2024-09-18
heal.recordProviderΠανεπιστήμιο Ιωαννίνων. Σχολή Επιστημών Υγείαςel
heal.recordProviderUniversity of Ioannina. School of Health Sciencesen
heal.typemasterThesisel
heal.type.elΜεταπτυχιακή εργασίαel
heal.type.enMaster thesisen

Αρχεία

Πρωτότυπος φάκελος/πακέτο

Προβολή: 1 - 1 of 1
Μικρογραφία εικόνας
Ονομα:
Μ.Ε ΣΥΜΕΩΝΙΔΟΥ ΜΑΡΙΑ (2024).pdf
Μέγεθος:
3.54 MB
Μορφότυπο:
Adobe Portable Document Format
Περιγραφή:
Κατεβάστε

Φάκελος/Πακέτο αδειών

Προβολή: 1 - 1 of 1
Μικρογραφία εικόνας
Ονομα:
license.txt
Μέγεθος:
3.22 KB
Μορφότυπο:
Item-specific license agreed upon to submission
Περιγραφή:
Κατεβάστε

Συλλογές

Διατριβές Μεταπτυχιακής Έρευνας (Masters) - ΙΑΤ